A lungo termine comportamentale inseguimento di Liberamente Nuoto debolmente elettrico Pesce

Sfondo. Esperienze quantitative sul comportamento animale (ad esempio scelta forzata, shock evitamento, T-labirinto, ecc.) Sono tipicamente utilizzati per studiare ipotesi specifiche riguardanti le abilità senso-motorie, di apprendimento e di formazione della memoria. Tuttavia, questi esperimenti restrittive perdere gran parte della ricchezza del comportamento animale naturale e sono suscettibili di tradursi in modelli semplificate del sottostante basi neurali del comportamento. Esperimenti in condizioni più naturalistiche sono quindi un complemento importante con il quale possiamo esplorare più a fondo un repertorio comportamentale specie. Esperimenti su animali liberi di muoversi, tuttavia, devono affrontare sfide tecniche uniche come artefatti di registrazione indotti dal movimento. A differenza di risposte stimolo-evocato, che si verificano spontaneamente il comportamento esplorativo non può essere previsto; quindi soggetti sperimentali devono essere costantemente monitorati e tracciati per un periodo di tempo prolungato. Domande di ricerca specifiche can essere meglio affrontati da organismi accuratamente selezionati e gli strumenti tecnici disponibili. Ad esempio, la registrazione e la stimolazione tecniche ottiche come sensori di calcio geneticamente codificato ¹ e optogenetics ² sono state applicate con successo per muoversi liberamente organismi modello genetiche ^3-5. In alternativa, sistemi di telemetria neurali miniaturizzati in grado di registrare e stimolare lo spostamento piccoli animali ^6,7 liberamente.

Pesci elettrici. Specie WEF generano scariche elettriche organi (EOD), che consentono loro di percepire le loro immediate vicinanze o di comunicare su distanze maggiori. Pattern temporali di EOD variano in condizioni diverse, come auto-movimenti ^8,9, stimoli sensoriali ^{10,11, 12,13} e le interazioni sociali. Pulse-specie tipo WEF producono un treno di impulsi discreti, a differenza delle specie di onda di tipo che generano forme d'onda quasi-sinusoidale continuo. In generale, di tipo impulsivo specie mostra more tasso variabile EOD rispetto alle specie d'onda di tipo e tassi EOD animali riflettere molto attentamente il contenuto della novità del loro ambiente sensoriali ^10,14. Specie Pulse-tipo possono ridurre immediatamente l'intervallo tra impulsi (IPI) all'interno di un singolo ciclo di impulso in risposta a una perturbazione sensoriale romanzo (risposta novità ^10,11,14). Il comportamento elettrico continuo di questi pesci può essere turbato da stimoli sensoriali incontrollate provenienti da fonti esterne, e diversi tipi di stimoli come vibrazione, suono, luce, e la luce sono noti risposte novità di trigger. Pertanto, speciali precauzioni devono essere adottate per bloccare o attenuare gli stimoli sensoriali esterni durante un'osservazione a lungo termine di nuotare liberamente WEF. In questo modo, variazioni della frequenza EOD e traiettorie di movimento possono essere specificamente attribuiti a stimoli presentati dallo sperimentatore.

Acquario serbatoio e camera di isolamento. Abbiamo quindi messo più strati di materiali ad assorbimento delle vibrazioni under un grande acquario (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e circondato il serbatoio con un involucro isolante per bloccare le fonti esterne di luce, rumore elettrico, il suono e flusso di calore. Tasso EOD dipende dalla temperatura circostante ^15,16, quindi la temperatura dell'acqua è strettamente regolata in un intervallo tropicale (25 ± 1 ° C) per le specie Sudamericana WEF. Abbiamo costruito un ampio e poco profondo (10 cm Profondità acqua) serbatoio per osservare i comportamenti esplorativi spaziali del WEF principalmente ristrette in due dimensioni (Figura 1A). Il serbatoio è stato ripartito in un'arena centrale di osservare i comportamenti spaziali, e quattro scomparti d'angolo per ospitare separatamente singoli pesci (Figura 1B). Ogni scompartimento è stato costruito a tenuta stagna per impedire la comunicazione elettrica tra gli individui. Accesso animali all'arena centrale è stato controllato dall'esterno da quattro porte motorizzate. I cancelli sono stati collocati tra i compartimenti, e divennero stagna quando è bloccatoda nylon ala-noci. L'assenza di parti metalliche sono stati usati sott'acqua dal WEF reagiscono sensibilmente ai metalli.

Registrazione EOD. EOD vengono generati in maniera stereotipata per l'attivazione di un singolo (in Mormiridi) o più organi elettrici spazialmente distribuiti (in Gymnotiforms) ^17,18. Modulazioni temporali del tasso di EOD possono rivelare attività neurali di livello superiore, dal momento che il pacemaker midollare riceve gli input neurali diretti da regioni cerebrali superiori, come il nucleo prepacemaker diencefalica, che a sua volta riceve le proiezioni assonale dal prosencefalo ^19. Tuttavia, i tempi EOD deve essere accuratamente estratta da una registrazione della forma d'onda prima e non polarizzato da distorsioni indotti dal movimento dell'animale. Il campo elettrico generato da un WEF può essere approssimato come un dipolo; quindi EOD ampiezze di impulso a elettrodi di registrazione dipendono dalle distanze relative e orientamenti tra l'animale e gli elettrodi ^8,20. Self-movem di Animalgenitori cambiano la geometria relativa tra l'animale e gli elettrodi, così spostamenti causano le ampiezze EOD a diversi elettrodi a variare nel tempo in modo volatile (vedere la Figura 2B Giu et al. ^8). Inoltre, l'auto-movimenti cambiano anche la forma delle forme d'onda registrate EOD, perché i contributi relativi da diverso insieme di organi elettrici dipendono dalle loro posizioni lungo la lunghezza del corpo e le loro curvature locali introdotta dalla coda flessione. Le distorsioni indotti dal movimento delle ampiezze e forme EOD possono portare a misure temporanee EOD imprecise e inaffidabili. Abbiamo superato questi problemi spazialmente media di forme d'onda multiple EOD registrate in luoghi diversi, e con l'aggiunta di un filtro di estrazione busta di determinare con precisione la tempistica EOD da un WEF nuotare liberamente. Inoltre, la nostra tecnica misura le ampiezze EOD, che indicano se un animale è a riposo o in movimento attivamente in base alla variazione della EODampiezze nel tempo (vedi figure 2E e 2F). Abbiamo registrato segnali differenziale amplificati dalle coppie di elettrodi di registrazione per ridurre il rumore di modo comune. Poiché gli impulsi EOD vengono generati a intervalli di tempo irregolari, l'evento time-series EOD hanno una frequenza di campionamento variabile. La serie temporale EOD può essere convertito in una frequenza di campionamento costante mediante interpolazione se richiesto da uno strumento analitico di scelta.

La registrazione del video. Sebbene la registrazione EOD può monitorare un'attività movimento lordo di un animale, registrazione video consente misurazioni dirette della posizione del corpo di un animale e la postura. Vicino infrarosso (NIR) illuminazione (λ = 800 ~ 900 nm) consente l'osservazione visiva imperturbabile di nuotare liberamente pesci ^21,22, dal momento che WEFs sono più attivi nelle tenebre ei loro occhi non sono sensibili alle NIR dello spettro ^23,24. La maggior parte dei sensori di immagini digitali (ad esempio, CMOS o CCD) in grado di acquisire spettro NIR con il wavelengtgamma h tra 800-900 nm, dopo aver rimosso una connessione a infrarossi (IR) bloccando il filtro ^25. Alcuni webcam consumer di fascia alta offrono alta definizione, ampio angolo di visualizzazione e una buona sensibilità low-light, che può produrre una qualità d'immagine paragonabile o superiore al livello professionale telecamere IR disponibili a costi molto maggiori. Inoltre, alcune webcam consumer-grade sono in bundle con software di registrazione che permette una durata di registrazione esteso da comprimere il video senza perdita di qualità. La maggior parte delle fotocamere di livello professionale offrono sincronizzazione TTL uscite impulsi di tempo o ingressi impulsi TTL grilletto ²⁶ per allineare i tempi tra il video con i segnali digitalizzati, ma questa caratteristica è generalmente assente in webcam consumer-grade. Tuttavia, i tempi tra una registrazione video e un digitalizzatore segnale può essere abbinato con precisione da concomitanza acquisizione di un IR periodicamente LED lampeggiante con la fotocamera e il digitalizzatore segnale. La sincronizzazione degli impulsi IR iniziale e finale può essere utilizzato uns due marcatori di calibrazione di tempo per convertire i numeri di fotogramma video l'unità di tempo segnale digitizer e viceversa.

Lighting & background. Cattura di immagini attraverso l'acqua può essere tecnicamente impegnativo a causa dei riflessi della luce sulla superficie dell'acqua. La superficie dell'acqua può agire come uno specchio per riflettere una scena visiva sopra l'acqua, e caratteristiche visive oscure subacqueo; quindi la scena di sopra dell'acqua deve essere reso featureless per evitare interferenza visiva. Per l'intera immagine acquario, una telecamera deve essere posizionato direttamente sopra l'acqua, e dovrebbe essere nascosto dietro il soffitto sopra un piccolo foro visualizzazione per impedire la sua riflessione sulla superficie dell'acqua. Inoltre, la superficie dell'acqua può produrre riflessi e illuminazione non uniforme se le sorgenti luminose sono proiettati in modo errato. Illuminazione indiretta può ottenere una luminosità uniforme su tutta acquario puntando le fonti di luce verso il soffitto, in modo tale che il soffitto e il wal circostantels può riflettere e diffondere i raggi di luce prima di raggiungere la superficie dell'acqua. Scegliere un illuminatore IR che corrisponde a una risposta spettrale della fotocamera (ad esempio 850 nm di lunghezza d'onda di picco). Il rumore elettrico dalle fonti di luce può essere minimizzato utilizzando luci a LED e piazzare i loro alimentatori in corrente continua al di fuori della gabbia di Faraday. Posizionare uno sfondo bianco sotto il serbatoio, dal pesce contrasta bene in uno sfondo bianco a lunghezze d'onda NIR. Analogamente, l'uso di colore bianco opaco sulle superfici interne della camera di isolamento fornisce uniforme e luminoso retroilluminazione.

Monitoraggio video. Dopo una registrazione video, un algoritmo di inseguimento automatico immagine può misurare posizioni e posture del corpo dell'animale nel tempo. Il monitoraggio video può essere eseguita automaticamente da una software pronto per l'uso (Viewpoint o Ethovision), o il software programmabile dall'utente (OpenCV o MATLAB Processing Toolbox Image). Come primo passo di inseguimento immagine,un'area inseguimento valido deve essere definito disegnando una forma geometrica di escludere l'area esterna (funzionamento mascheratura). Successivamente, l'immagine di un animale deve essere isolato dal contesto sottraendo un'immagine di sfondo da un'immagine contenente l'animale. L'immagine sottratta viene convertito in un formato binario applicando una soglia di intensità, in modo tale che il baricentro e l'asse di orientamento possono essere calcolate dalle operazioni morfologiche binarie. In Gymnotiforms ^27-29 e ^30-32 Mormiridi, la densità electroreceptor è il più alto vicino alla regione della testa, quindi la posizione della testa in qualsiasi momento, indica una posizione di massima acutezza sensoriale. Le posizioni di testa e di coda possono essere determinate automaticamente applicando le operazioni di rotazione dell'immagine e del riquadro di delimitazione. Le estremità di testa e di coda possono essere distinti l'uno dall'altro da essi definendo manualmente nel primo frame, e tenendo traccia delle rispettive posizioni dal confronto di due quadri successivi.