Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Fundo. Experimentos quantitativos sobre o comportamento animal (por exemplo, escolha forçada, evitar o choque, T-labirinto, etc.) São normalmente utilizados para investigar hipóteses específicas sobre as habilidades sensório-motoras, aprendizagem e formação da memória. No entanto, estas experiências restritivas perder muito da riqueza do comportamento natural dos animais e são susceptíveis de resultar em modelos simplistas da base neural subjacente de comportamento. Experimentos em condições mais naturalistas são, portanto, um complemento importante pelo qual podemos explorar mais plenamente um repertório comportamental das espécies. Experiments envolvendo animais circulando livremente deve, porém, enfrentar os desafios técnicos exclusivos, como artefatos de gravação induzida pelo movimento. Ao contrário de respostas evocadas por estímulo, o comportamento exploratório de ocorrência espontânea não pode ser previsto, portanto, sujeitos experimentais têm de ser constantemente monitorados e acompanhados durante um período prolongado de tempo. Questões específicas de investigação can ser melhor abordados por organismos cuidadosamente selecionados e instrumentos técnicos disponíveis. Exemplo, gravação e estimulação técnicas ópticas como sensores cálcio geneticamente codificados ^1.oe optogenética ² foram aplicado com sucesso movendo livremente organismos modelo genéticos ^3-5. Alternativamente, sistemas de telemetria neural miniaturizados pode gravar e estimular livremente mover pequenos animais ^6,7.

Peixe elétrico. Espécies WEF gerar descargas elétricas de órgãos (EODs), que lhes permitem perceber seu entorno imediato ou se comunicar através de distâncias maiores. Padrões temporais de EODS variar em diferentes condições, tais como auto-movimentos, ^8,9 estímulos sensoriais ^10,11 e interações sociais ^12,13. Espécies WEF tipo pulso produzir um trem de pulsos discretos, ao contrário de espécies do tipo de onda para que geram formas de onda quase-senoidal contínua. Em geral, do tipo pulso exposição espécie more taxa de EOD variável em comparação com as espécies do tipo de onda, e as taxas de EOD dos animais refletem intimamente conteúdo da novidade de seu entorno sensoriais ^10,14. Espécies do tipo de pulso pode reduzir imediatamente o intervalo inter-pulso (IPI) dentro de um único ciclo de pulso em resposta a uma perturbação sensorial novel (resposta novidade ^10,11,14). O comportamento elétrico contínuo desses peixes pode ser perturbado por estímulos sensoriais descontrolados de fontes externas, e diferentes tipos de estímulos, tais como vibração, som, eletricidade e luz são conhecidas respostas novidade gatilho. Portanto, devem ser tomadas precauções especiais para bloquear ou atenuar os estímulos sensoriais externos durante uma observação a longo prazo de livre-natação WEF. Deste modo, as alterações na taxa de EOD e trajectórias de movimento podem ser especificamente atribuído ao estímulo apresentado pelo experimentador.

Tanque do aquário e câmara de isolamento. Nós, portanto, colocado várias camadas de materiais absorventes de vibração under um grande tanque do aquário (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e cercaram o tanque com um compartimento isolado para bloquear fontes externas de luz, ruídos elétricos, som e fluxo de calor. Taxa EOD depende da temperatura em torno ^15,16, assim a temperatura da água foi estritamente regulada em uma faixa tropical (25 ± 1 º C) por espécies sul-americanas WEF. Construímos um tanque grande e raso (10 cm de profundidade de água) para observar comportamentos exploratórios espaciais da WEF principalmente restritas em duas dimensões (Figura 1A). O tanque foi dividido em uma área central para observar o comportamento espacial e quatro compartimentos de canto para alojar separadamente cada peixe (Figura 1B). Cada compartimento foi construído à prova d'água para impedir a comunicação elétrica entre os indivíduos. O acesso dos animais para a arena central foi controlado a partir do exterior por quatro portões motorizados. Os portões foram colocados entre os compartimentos, e tornaram-se estanque quando fechadaspor nylon asa-nozes. Sem partes metálicas foram usados ​​debaixo d'água desde WEF reagir com sensibilidade para os metais.

Gravação EOD. EODS são gerados de forma estereotipada pela ativação de um único (em Mormyrids) ou múltiplos órgãos elétricos espacialmente distribuídos (em gymnotiforms) ^17,18. Modulações temporais na taxa EOD pode revelar atividades neurais de nível superior, uma vez que o marcapasso medular recebe entradas neurais diretos a partir de regiões mais elevadas do cérebro, como o núcleo prepacemaker diencefálica, que por sua vez recebe projeções axonais do cérebro anterior ^19. No entanto, o momento EOD deve ser cuidadosamente extraído de uma gravação do sinal bruto e não influenciada por distorções induzidas pelo movimento do animal. O campo elétrico gerado por um WEF pode ser aproximado como um dipolo, assim EOD amplitudes de pulso de eletrodos de registro depende das distâncias relativas e orientações entre o animal e os eletrodos ^8,20. Auto-movem de Animaisentos alterar a geometria relativa entre o animal e os eléctrodos, assim, fazer com que os movimentos das amplitudes EOD em diferentes eléctrodos para variar ao longo do tempo de uma forma volátil (ver Figura 2B em junho et al. ^8). Além disso, a auto-movimentos também mudar a forma de ondas EOD gravadas, porque as contribuições relativas de jogo diferente dos órgãos elétricos dependem de suas posições ao longo do comprimento do corpo e suas curvaturas locais introduzida pela cauda flexão. As distorções induzidas pelo movimento nas amplitudes e formas EOD pode levar a medições imprecisas e não confiáveis ​​de tempo EOD. Nós superamos estes problemas espacialmente média de múltiplas formas de onda EOD gravados em diferentes locais, e pela adição de um filtro de extração de envelope para determinar com precisão o momento de uma EOD WEF livre de natação. Além disso, a técnica também mede as amplitudes EOD, que indicam se um animal está em repouso ou em movimento activa com base na mudança da EODamplitudes ao longo do tempo (ver Figuras 2E e 2F). Gravamos sinais diferencialmente amplificados dos pares de eletrodos de gravação para reduzir o ruído de modo comum. Uma vez que os impulsos são gerados EOD em intervalos de tempo irregulares, o evento de séries temporais EOD tem uma taxa de amostragem variável. As séries de tempo EOD pode ser convertido para uma taxa de amostragem constante, por interpolação, se necessário por uma ferramenta analítica de escolha.

A gravação de vídeo. Embora a gravação EOD pode monitorar uma atividade de movimento bruto de um animal, gravação de vídeo permite que medições diretas de posição do corpo de um animal e postura. Near-infrared (NIR) iluminação (λ = 800 ~ 900 nm) permite a observação visual imperturbável de nadar livremente peixe ^21,22, uma vez que WEFs são mais ativos nas trevas e seus olhos não são sensíveis ao espectro NIR ^23,24. A maioria dos sensores de imagem digital (por exemplo, CMOS ou CCD) pode capturar espectro NIR com o wavelength intervalo entre 800-900 nm, após a remoção de uma ligação por infravermelhos (IR), o bloqueio do filtro ^25. Alguns high-end webcams consumidor da classe oferecem alta definição, amplo ângulo de visão e boa sensibilidade de pouca luz, o que pode produzir uma qualidade de imagem comparável ou superior ao nível profissional câmeras IR disponíveis em muito maiores custos. Além disso, algumas webcams consumidor da classe são empacotados com o software de gravação que permite uma duração de gravação estendida através da compressão de vídeo sem perda de qualidade. A maioria das câmeras de nível profissional oferecer sincronização saídas de pulso TTL de tempo ou entradas de pulso TTL gatilho ²⁶ para alinhar o sincronismo entre o vídeo com os sinais digitalizados, mas esse recurso é geralmente ausente em webcams consumidor da classe. No entanto, o tempo entre a gravação de vídeo e um digitalizador de sinal pode ser combinado com precisão por simultaneamente capturando uma IR piscar periodicamente LED com a câmera eo digitador sinal. O tempo inicial e final de pulso de IR pode ser usado ums dois marcadores de calibração de tempo para converter os números de quadro de vídeo para a unidade de tempo digitalizador de sinal e vice-versa.

Iluminação e fundo. Captura de imagens através da água pode ser tecnicamente desafiadora devido aos reflexos de luz na superfície da água. A superfície da água pode atuar como um espelho para refletir uma cena visual acima da água, e as características visuais obscuros subaquático; assim, a cena acima da água deve ser processado inexpressivo para evitar a interferência visual. A fim de imagem de todo o aquário, uma câmera precisa ser colocado diretamente sobre a água, e ele deve ser escondido atrás do teto ao longo de um pequeno buraco de visão para evitar a sua reflexão sobre a superfície da água. Além disso, a superfície da água pode produzir brilhos e iluminação não uniforme, se as fontes de luz são incorretamente projetada. Iluminação indireta pode alcançar brilho uniforme ao longo de todo o aquário apontando as fontes de luz em direção ao teto, de modo que o teto eo wal circundantels pode refletir e difundir os raios de luz antes de atingir a superfície da água. Escolha um iluminador IR que corresponde a uma resposta espectral da câmera (por exemplo, 850 nm de comprimento de onda de pico). O ruído elétrico das fontes de luz podem ser minimizados usando luzes de LED e colocando suas fontes de alimentação de corrente contínua fora da gaiola de Faraday. Coloque um fundo branco por baixo do tanque, uma vez que os peixes contrasta bem em um fundo branco em comprimentos de onda NIR. Da mesma forma, a utilização de mate cor branca sobre as superfícies internas da câmara de isolamento proporciona uma iluminação de fundo uniforme e brilhante.

Monitoramento de vídeo. Depois de uma gravação de vídeo, um algoritmo automatizado de seguimento de imagem podem medir posições e posturas do corpo do animal ao longo do tempo. O rastreamento de vídeo pode ser realizado automaticamente por qualquer software pronto para uso (ou Ponto de Vista Ethovision), ou software programável pelo usuário (OpenCV ou MATLAB Imagem processamento caixa de ferramentas). Como primeiro passo de rastreamento de imagem,uma área de rastreamento válido precisa ser definido pelo desenho de uma forma geométrica para excluir a área externa (mascarando a operação). Em seguida, a imagem de um animal precisa de ser isolado a partir da base, subtraindo uma imagem de fundo a partir de uma imagem que contém o animal. A imagem subtraída é convertido para um formato binário pela aplicação de um limiar de intensidade, de modo a que o baricentro e o eixo de orientação pode ser calculado a partir de operações morfológicas binários. Em gymnotiforms ^27-29 e ^30-32 Mormyrids, a densidade electroreceptor é a mais alta perto da região de cabeça, assim, a posição da cabeça a qualquer momento indica uma localização da maior acuidade sensorial. Os locais da cabeça e da cauda pode ser determinado automaticamente pela aplicação das operações de rotação de imagem e da caixa envolvente. A cabeça ea cauda extremidades podem ser distinguidos um do outro, definindo-os manualmente no primeiro quadro, e por manter o controle de seus locais de comparar dois quadros sucessivos.