Langdurige Behavioral Tracking van Vrij Zwemmen Zwak Electric Fish

Achtergrond. Kwantitatieve experimenten op het gedrag van dieren (bijvoorbeeld gedwongen keuze, schokken vermijden, T-doolhof, enz.) Worden meestal gebruikt om specifieke hypotheses te onderzoeken met betrekking tot sensorische-motorische vaardigheden, leren en geheugen vorming. Echter, deze beperkende experimenten missen een groot deel van de rijkdom van het natuurlijke gedrag van dieren en zullen waarschijnlijk leiden tot ongenuanceerde modellen van de onderliggende neurale basis van gedrag. Experimenten onder meer naturalistische omstandigheden zijn daarom een ​​belangrijke aanvulling waarmee we meer volledig een soort gedragsrepertoire verkennen. Experimenten met vrij bewegende dieren moeten echter aanpakken unieke technische uitdagingen zoals-beweging geïnduceerde opname artefacten. Unlike-stimulus opgewekte responsen kunnen spontaan optredende verkennende gedrag te voorspellen, dus proefpersonen moeten voortdurend worden gecontroleerd en gevolgd gedurende een langere tijdsperiode. Specifieke onderzoeksvragen can best worden aangepakt door zorgvuldig geselecteerde organismen en beschikbare technische hulpmiddelen. Bijvoorbeeld zijn optische registratie-en stimulatie technieken zoals genetisch gecodeerde calcium sensoren ¹ en ² optogenetics succes toegepast op vrijdraaiende genetisch modelorganismen ^3-5. Als alternatief kan geminiaturiseerde neurale telemetrie systemen op te nemen en vrij te stimuleren bewegende kleine dieren ^6,7.

Elektrische vissen. WEF soorten genereren elektrisch orgel ontladingen (EODs), die hen in staat stellen om hun directe omgeving te voelen of om te communiceren over grotere afstanden. Temporele patronen van EODs afwijken onder andere omstandigheden zoals zelf-bewegingen ^8,9, zintuiglijke prikkels ^10,11, en ​​sociale interacties ^12,13. Pulsvormig WEF soorten produceren een trein van discrete pulsen, in tegenstelling tot golf-achtige soorten die voortdurend quasi-sinusoïdale golfvormen genereren. In het algemeen, pulse soorten ingevoerd tentoonstelling more variabele EOD in vergelijking met de golf-achtige soorten, en de dieren 'EOD tarieven nauw weerspiegelen nieuwigheid inhoud van hun zintuiglijke omgeving ^10,14. Puls-achtige soorten kunnen direct verkorten van de interval tussen pulsen (BIV) binnen een enkele puls cyclus reageren op een nieuwe zintuiglijke verstoring (novelty reactie ^10,11,14). De lopende elektrische gedrag van deze vis kan worden verstoord door ongecontroleerde sensorische prikkels uit externe bronnen, en verschillende soorten stimuli zoals trilling, geluid, elektriciteit en licht zijn bekend trekker nieuwheid reacties. Daarom moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om tijdens een langdurige observatie van vrij zwemmende WEF externe zintuiglijke prikkels blokkeren of verzwakken. Zo kunnen veranderingen in EOD snelheid en beweging trajecten specifiek toegeschreven aan stimuli door de experimentator.

Aquariumtank en isolatiekamer. We meerdere lagen van vibratie absorberende materialen geplaatst dus under een groot aquarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), en omringden de tank met een geïsoleerde behuizing voor externe lichtbronnen, elektrische ruis, geluids-en warmte flux blokkeren. EOD is afhankelijk van de omgevingstemperatuur ^15,16, waardoor de temperatuur van het water is strak gereguleerd op een tropisch bereik (25 ± 1 ° C) voor Zuid-Amerikaanse WEF soorten. We bouwden een groot en ondiep (10 cm waterdiepte) tank naar ruimtelijke verkennende gedrag van WEF hoofdzakelijk beperkt in twee dimensies (figuur 1A) te observeren. De tank werd verdeeld in een centrale arena om ruimtelijke gedrag te observeren, en vier hoeken compartimenten afzonderlijk te huisvesten afzonderlijke vissen (Figuur 1B). Elk compartiment is gebouwd waterdichte elektrische communicatie tussen individuen te voorkomen. Toegang dieren aan de centrale arena werd gecontroleerd van buitenaf door vier gemotoriseerde poorten. De hekken werden geplaatst tussen de compartimenten, en zij werden waterdicht indien geslotendoor nylon vleugel-moeren. Geen metalen onderdelen werden onderwater gebruikt sinds WEF reageren gevoelig voor metalen.

EOD opnemen. EODs worden gegenereerd in een stereotiepe wijze door activering van enkele (in Mormyrids) of meerdere ruimtelijk verdeeld elektrische orgels (in Gymnotiforms) ^17,18. Temporal modulaties in de EOD tarief kan onthullen hogere neurale activiteiten, omdat het medullaire pacemaker ontvangt directe neurale input van hogere hersengebieden zoals de diencephalic prepacemaker kern, die omgekeerd is axonale projecties van de voorhersenen ^19. Wel moet de EOD timing zorgvuldig worden geëxtraheerd uit een ruwe golfvormregistratie en niet beïnvloed door beweging geïnduceerde verstoringen van het dier. Het elektrische veld dat door een WEF kan worden benaderd als een dipool, dus EOD pulsamplitude bij registrerende elektroden afhankelijk van de relatieve afstanden en oriëntaties tussen het dier en de elektroden ^8,20. Self-movem dierouders veranderen de relatieve geometrie tussen het dier en de elektroden, waardoor bewegingen veroorzaken de EOD amplitudes op verschillende elektroden te variëren in de tijd in een vluchtige wijze (zie figuur 2B in juni et al.. ^8). Bovendien, self-bewegingen ook veranderen de vorm van opgenomen EOD golfvormen, omdat de relatieve bijdragen van de verschillende set van de elektrische organen afhankelijk van hun locaties langs de lichaamslengte en hun lokale krommingen geïntroduceerd door staart buigen. De beweging veroorzaakt verstoringen in de EOD amplitudes en vormen kunnen leiden tot onnauwkeurige en onbetrouwbare EOD timing metingen. We losten deze problemen door het ruimtelijk gemiddelde van meerdere EOD golfvormen opgenomen op verschillende locaties, en door het toevoegen van een envelop extractie filter om precies te bepalen de EOD timing van een vrij zwemmende WEF. Bovendien, onze techniek meet ook de EOD amplitudes, die aangeeft wanneer een dier rust of actief bewegen gebaseerd op de verandering van de EODamplitudes in de tijd (zie de figuren 2E en 2F). We namen differentieel versterkte signalen van de registratie-elektrode paren common-mode ruis. Omdat de EOD pulsen worden gegenereerd op onregelmatige tijdsintervallen, de EOD event time-serie hebben een variabele sampling rate. De EOD tijdreeksen kan een constante sampling rate worden geconverteerd door interpolatie indien vereist door een analytisch instrument van keuze.

Video-opname. Hoewel EOD opname een grove beweging activiteit van een dier kan monitoren, video-opname maakt directe metingen van het lichaam van positie en houding van een dier. Nabij-infrarood (NIR) verlichting (λ = 800 ~ 900 nm) maakt onverstoorbaar visuele waarneming van vrij zwemmende vissen ^21,22, omdat WEFs zijn het meest actief in de duisternis en hun ogen zijn niet gevoelig voor NIR spectrum ^23,24. De meeste digitale beeldsensoren (bijv. CMOS of CCD) kan NIR spectrum vastleggen met de wavelength range tussen 800-900 nm, na het verwijderen van een infrarood (IR) sperfilter ^25. Sommige high-end consumenten-grade webcams bieden high-definition, grote kijkhoek en goede gevoeligheid bij weinig licht, die kan produceren een beeldkwaliteit die vergelijkbaar is met of beter dan professionele IR-camera's beschikbaar tegen veel hogere kosten. Daarnaast worden bepaalde consumenten-grade webcams gebundeld met opname-software die een langere opnameduur mogelijk maakt door video comprimeren zonder kwaliteitsverlies. De meeste professionele camera's bieden tijdsynchronisatie TTL impulsuitgangen of trigger TTL pulsingangen ²⁶ voor het uitlijnen van de timing tussen de video met de gedigitaliseerde signalen, maar deze functie is veelal afwezig in consumenten-grade webcams. Echter, de timing tussen een video-opname en een signaal digitizer nauwkeurig worden geëvenaard door gelijktijdig vastleggen van een periodiek knipperende IR LED met de camera en het signaal digitizer. De eerste en de laatste puls IR timing kan worden gebruikt eens twee tijdkalibratiesig markering voor de framenummers omzetten om het signaal digitizer tijdseenheid en vice versa.

Verlichting & achtergrond. Vastleggen van het beeld door het water kan zijn technisch uitdagend door lichtreflecties in het water oppervlak. Het wateroppervlak kan fungeren als een spiegel om een ​​visuele scène boven water, en obscure visuele kenmerken onderwater weerspiegelen, dus de scène boven water moet karakterloze worden gemaakt om visuele interferentie te voorkomen. Om het imago van de hele aquarium, een camera moet direct boven het water te worden geplaatst, en het moet worden verborgen achter het plafond over een kleine doorkijk naar de reflectie op het water oppervlak te voorkomen. Bovendien kan het water oppervlak glans en ongelijkmatige verlichting opleveren als lichtbronnen verkeerd worden geprojecteerd. Indirecte verlichting kan een uniforme helderheid te bereiken over het gehele aquarium door te streven de lichtbronnen in de richting van het plafond, zodat het plafond en de omringende walls kunnen reflecteren en verspreiden de lichtstralen vóór het bereiken van het wateroppervlak. Kies een IR schijnwerper die overeenkomt met een spectrale respons van de camera (bijv. 850 nm piek golflengte). Elektrische ruis van de lichtbronnen kan worden geminimaliseerd door het gebruik van LED-verlichting en het plaatsen van hun DC-voedingen buiten de kooi van Faraday. Plaats een witte achtergrond onder de tank, omdat vis contrasteert heel mooi in een witte achtergrond bij NIR golflengten. Ook het gebruik van matte kleur op de binnenoppervlakken van de isolatiekamer levert uniforme en heldere achtergrondverlichting.

Video tracking. Na een video-opname, kan een geautomatiseerde beeldtracking algoritme van het dier lichaamshoudingen en houdingen in de tijd te meten. De video-tracking kan automatisch worden uitgevoerd door een van beide kant-en-klare software (Viewpoint of Ethovision), of door de gebruiker programmeerbare software (OpenCV of MATLAB Beeldverwerking toolbox). Als eerste stap van beeldtracking,een geldig tracking gebied moet worden gedefinieerd door het tekenen van een geometrische vorm om buiten het gebied uit te sluiten (maskeren werking). Vervolgens afbeelding van een dier nodig heeft van de achtergrond te worden geïsoleerd door een achtergrondafbeelding af te trekken van een afbeelding met het dier. De afgetrokken beeld wordt omgezet in een binair formaat door toepassing van een intensiteit drempel, zodat het zwaartepunt en de oriëntatie as kan worden berekend uit binaire morfologische bewerkingen. In Gymnotiforms ^27-29 en Mormyrids ^30-32, de Elektroreceptor dichtheid is de hoogste in de buurt van het hoofd regio, dus de positie van het hoofd op ieder moment duidt op een locatie van de hoogste zintuiglijke scherpte. De kop en de staart locaties kan automatisch worden bepaald door toepassing van de beeldrotatie en begrenzingsvak operaties. De kop en de staart uiteinden kunnen worden van elkaar onderscheiden door ze handmatig te definiëren in het eerste frame, en door het bijhouden van hun locaties uit de vergelijking van twee opeenvolgende frames.