潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

酵素アッセイは、潜在的なEEASを定量化するために、同様の試料間で活性を比較するために使用することができる。ここでは、上昇し、CO 2と加熱処理（EHN）（ 図2-6）にさらされた土壌に周囲の気候条件（ACN）を経験した土壌を比較する実験的な気候研究から代表的な結果を提示する。全てのプロットにおける植物カバー（HBK）C4草Bouteloua薄によって支配北部混合草の草原の特性LAGた。および2のC3の草、Hesperostipa comata TRINとRupr。とPascopyrumスミシー （Rydb.）は、植物の約20％がスゲや広葉草本で構成されている。サイトの説明とフィールド実験計画の詳細については、参考文献28〜30に記載されています。土壌は、改変された気候cに応答して、土壌EEASを評価するために、直径1.5cmのコアを用いた治療プロットの各々内の2つの異なる深さ（0〜5センチ、5〜15センチメートル）から回収したonditions。我々の例では（ すなわち、 図2-6）、サンプルサイズは、（N = 3）。この関係なく最小のサンプルサイズのばらつきは、ほとんどの場合、比較的小さい（エラーバーによって示されるように）及びロバスト処理区のうちEEAS電位の変動を反映している。分散（ANOVA）およびテューキーの事後多重比較の分析は、処置プロット及び土壌の深さのうち、酵素活性の有意なシフトを同定するために使用した。 以下の代表的な結果は、このハイスループット蛍光アッセイ（2）がどのようにEEA化学量論（3）の関係エコシステムレベルプロセスを示すことができ、土壌中（1）全体的なEEAを試験するために使用することができる方法を示すために提供されている培養温度とEEAの間。土壌EEAのは、一般的に土壌の栄養循環に微生物の機能の変化を関連付ける研究され、気候変動、植物群落のに応じて、微生物の栄養要求を評価するための有用な指標hifts、およびより広範に31-33を機能して生態系。 EEAの化学量論は、より最近の環境条件5に該当する可能性のある微生物の栄養の不均衡を評価するために生態化学量論的理論と生態学の代謝理論を交差させることにより、土壌生化学栄養循環を評価するための指標として採用されている。多くの研究は、広い化学量論比が栄養生長の制限34-36の指標であることが示唆されていると、土壌養分が限られるようになり、微生物は、栄養素欠乏37を取得する特定の酵素を産生する代謝資源を割り当てることによって応答する。 Ecoenzymatic C：N：Pの化学量論比は、様々な環境摂動に応じて潜在的な微生物群集の栄養需要の相対的なシフトを識別するのに有用である5。最後に、EEASの温度感度は、土壌微生物コミュニティの機能的多様性は可能性が温度変化に影響されるかを評価するのに役立ちます。<SUP> 7,38。酵素の温度感受性は、広く歴史的条件7から気候の変化に対応する酵素活性の変化を示した酵素を生産する単一の酵素クラスの土壌、および微生物群集の間で変化することができる。このためのEEの熱生態に関連する酵素活性の質問は39,40を変更し 、気候に応じて、微生物の機能的なダイナミクスと地下部生態系プロセスを評価するための便利な方法です。 この例では、潜在的なC-、N-、および0-5センチメートルの深さで土壌アッセイP-酵素捕捉活性は実験的治療（図2a）で差がなかった。しかし,5-15センチの土壌の深さで、いくつかの潜在的なEEASは有意に（ 図2b）を異なるました。 ACNプロットに比べて、例えば、C分解酵素は、β-1、4 -グルコシダーゼ、β-D-セロビオはEHNプロット（ 図2b 0.038≤P）で低かった。 NおよびP鉱夫5〜15センチメートル土壌深さでACNに比べて、alizing酵素は、（β-1、4-N-アセチルおよびホスファターゼ、それぞれ）EHNプロット（ 図2b 0.012≤P）も低かった。 の和を計算し、プロットするすべてのC-、N-又はP-サイクリングEEAS電位が電位土壌C-、N-及び/又はP-サイクル（ 図3）に関する広範なパターンを観察するための有用なアプローチであることができる。この例では、β-1、4 – グルコシダーゼ、β-D-セロビオヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、及びα-1、4 – グルコシダーゼ電位EEASの合計が電位Cサイクリング活動を表すために計算された。 β-1 ,4-N-アセチルグルコサミニダーゼ、およびL-ロイシンアミノペプチダーゼとの和は、潜在的なNサイクリング活動を表すために計算された。ホスファターゼ電位Pサイクリング活動を表すために使用した。この例では、合計の潜在EEAS Cは-、N-およびP-サイクリング5-15センチメートルの深さで土壌ACNプロット（ ふぃぎゅに比べEHNプロットに低い傾向再3）。しかし、この傾向は（0.046≤P; 図3）全NとPサイクリング活動のためにのみ有意であった。土壌EEASは有意に（ 図3）0〜5センチメートル土壌深度で治療プロット間で差は認められなかった。この実施例の知見は、土壌の深さに応じて処置プロット（EHN対ACN）の間で、酵素活性官能基（ すなわち、C-、N-、P又は分解酵素）に対照的な傾向を示唆している。例えば、周囲のプロット（ACN）中のC-、N-およびP-分解する土壌EEASは、逆のパターン（図3a〜cを実証高められたCO 2及び加熱（EHN）に露出土壌に比べて、より低い深さにおいてより高い傾向）。 酵素化学量論は、環境（ 図4）の潜在的な酵素活性を評価するためのもう一つの有用なアプローチである。栄養素微生物の需要は、環境に関連した微生物バイオマスの元素の化学量論によって決定されます栄養素利用32。同様に、微生物はまた、生態学的な化学量論41と称されるそれらの土壌の環境内での栄養要求を満たすために、特定の酵素（ すなわち、C-、N-又はP-分解酵素）を産生する。潜在EEASの割合は微生物の栄養要求性を評価する一つの方法です。例えば、（Cの例：N栄養素買収）の官能基を酵素2間の1:1の比率は、微生物バイオマスCを考慮した場合、Nの需要は、Cの需要に比べて高いであることを示唆している。N比コミュニティレベルで典型的には、8時01分42である。この例では、土壌の酵素化学量論C：N、C：P、又はN：P活性は有意に0〜5センチメートル土壌の深さ（ 図4a〜c）に処置プロット間で異なる。しかし、潜在的な酵素のC：PおよびN：P比はEHNに高かった5〜15センチメートル土壌深さでACNプロットと比較したプロット（P = 0.05; 図4Bおよび4C）。この観察結果は示唆していることがある相対的に高いP無機化EEAS 5-15センチの土壌の深さで、CおよびN EEAに（EHNに比べて）のACNプロットを比較する。酵素のC：NのためEHNと比較して、低い深さで、ACNプロットにおける高い電位C EEASに（ 図4a）：N買収活動率が高いCとの合計、C EEASによって証明と同様の傾向を示した。 温度が強く、土壌EEASに影響を与えることができる。しかし、典型的な実験室アッセイにおいて、土壌酵素はその場温度条件にに対応しない場合が単一の温度で測定される。私たちの蛍光酵素アッセイ法は、私たちは、比較のために、複数の研究室のインキュベーション温度を組み込むことにより、 その場の温度効果に考慮することができます。複数の温度で実験室のインキュベーションを使用したボランティアアレニウスプロットとQ 10の計算を用いた温度依存性酵素動力学データを解析することを可能にする。アレニウスプロットは、活性化エネルギーを可視化するために使用されると、我々をプロットするx軸上ケルビン度（1 / K）に変換し、逆温度の関数としての酵素活性の対数（y軸従属変数）ING（ すなわち、独立変数、 図5a-c）の 。活性化エネルギーは、一般に、化学反応（ すなわち、より小さな製品に所定の基質を分解する）を触媒するのに必要な最小エネルギーとして定義される。我々の目的のために、活性化エネルギーは、酵素触媒反応の温度感受性のプロキシとして機能する。より高い活性化エネルギーは、酵素温度感受性を示している。同様に、活性化エネルギー（ すなわち 、図5D-F）は 、直接、Q 10値（ すなわち 図6a-C）に対応しています。活性化エネルギーと実用化を計算するために使用される数式の詳細な説明が多く、過去に記載されています40,43-45に動作します。アレニウスプロット、活性化エネルギー、及びQ 10のプロットは、冗長な情報を提供しないはずすべての出版物についてのデータを提示するために、同じ原稿に使用すること（ 図5および6）。動態データ10 -これらの技術を使用した場合、したがって、それは、酵素の温度に最も適したプロットタイプを選択する必要がある。すべてのプロットタイプ（アレニウスとQ 10）は、デモ目的のためにここに提示された。酵素の結果を提示する方法の視覚的な例を提供する。 我々の例では、潜在的なC-、N-、二つの土壌深さで両方の治療プロット間のP-EEASのための潜在的な酵素動力学評価した （ 図5、図6）。発見は、EEASの温度感受性がアレニウスプロット（ 図5a-c）、および対応する活性化エネルギー（ 図DF）と（驚くべきことではないが）、Qのために示されているように活性化エネルギーのための土壌の深さのいずれかでの治療プロット間で有意差は認められなかったことを示した10 PLOtsは（15°Cと25°Cの実験室のインキュベーションの間に、この例では、 図6A〜図6C）。これは、酵素反応速度論は、この特定の研究におけるフィールド実験処理によって影響を受けなかったことを示唆している。 表1。土壌サンプルの蛍光標準濃度用のディープウェルプレートのデザイン。テンプレート前インキュベートするディープウェルプレートに土壌サンプルの蛍光基準（MUBまたはMUC）を組織し、ロードするため。注：列は、同じ土壌サンプル（土壌スラリー添加の800μl）を表す。蛍光標準濃度の勾配は、各行（200μL追加）のためにロードされます。各セルは、蛍光標準濃度プラス土壌スラリーの追加を表しています。例えば、S1 – S12が土壌サンプル（土壌スラリー800μl）を表し、MUB 0〜100μM= 4 – Methylumbelliferone濃度（200μlの追加）。この例では、行Hは開放されており、必要に応じて、より高い蛍光標準濃度を含むように結果的に利用可能である。標準曲線濃度を増加させるために、この決定は、特定の土壌サンプルについて（および/または基質濃度を用いる）より高い電位酵素活性に必要であり得る。あなたのサンプルのための潜在的な酵素活性は、標準曲線の値の範囲内にある必要があります。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。 表2。整理前インキュベートするディープウェルプレートに土壌サンプルと基板をロードするための基板。テンプレートを使用した土壌サンプルのためのディープウェルプレート設計 。注：列は、同じ土壌サンプル（SO800μlのを表している書記スラリー付加）。異なる基板は、各行（200μL添加物）を横断ロードされます。各セルは、土壌サンプルを加えた基質添加を表す。例えば、S1 – S12がユニークな土壌サンプル（土壌スラリー800μl）を表す。基板（200μL添加物）としては、BG = 4 – メチルβ-D-グルコピラノシドを、CBは= 4 – メチルβ-D-セロビオシド、NAGは、4 – メチルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを=; PHOS = 4 – メチルウンリン酸塩：XYL = 4 – メチルウンベリフェリル-β-D-キシロピラノシド、AG = 4 – メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド;及びLAP = L-ロイシン-7-アミド-4 – メチルクマリン塩酸塩。この例では、行Hは開放されており、必要に応じて別の潜在的な酵素活性を評価するために別の基板を含めるようにし、結果として提供されています。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。 温度 時間 4℃ 〜23時間 15℃ 6時間 25°C 3時間 35°C 1.5時間 表3。インキュベーション時間期間を対応するために必要なインキュベーター温度。インキュベーション温度および酵素アッセイ法のための対応する時間期間。 表4。 MUBおよびMUC標準曲線の計算。A）を整理する方法を示しMUBとb）MUC未加工の蛍光データ（マイクロモル）を、その後、傾き、y切片、およびR二乗値を計算する。あなたの標準濃度曲線から傾き、y切片、およびR二乗値を計算し選択する（またはプロット）独立変数（x軸）のような従属変数（y軸）及び標準濃度（マイクロモル）としてMUBおよび/またはMUC生の蛍光データ。注意：MUB = 4 -メチルウンベリフェロン; MUC = 7 -アミノ-4 -メチル。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。 表5。 。マイクロモルの活動/ g乾燥土壌/時： 酵素活性の計算は、a）試料生の蛍光データを整理し、その後にEEASを計算する（BF）を必要なステップを実行する方法を示します。注意：S1 – S12のユニークな土壌サンプルを表しています。基板は、次のとおりです。= 4 – メチルβ-D-グルコピラノシド、BG、CB = 4 – メチルβ-D-セロビオシド、NAGは4 – メチルウンN-アセチル-β-D-グルコサミニドを=; PHOS = 4 – メチルウンフォーをsphate：XYL = 4 -メチル-β-D-キシロピラノシド; AG = 4 -メチルα-D-グルコピラノシド、およびLAP = L-ロイシン-7-アミド-4 -メチルクマリン塩酸塩。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。 図1。 MUB従属変数（y軸）としての生の蛍光データを標準曲線の検量線プロット。散布図の可視化と標準濃度（マイクロモル）独立変数（x ​​軸）とする。 図2。 C、NおよびPサイクリング酵素活性 。プレーリー暖房や高架のCO 2エン電位EEASrichment対照区における（PHACE）部位（ACN：周囲気候条件に曝露）および処置プロット（EHN：温度上昇にさらされ、CO 2の上昇）。土壌の酵素は、A）0〜5センチメートル土壌の深さと、b）5〜15センチメートル土壌の深さで測定した。 。EHN =上昇、CO 2と加熱プロット、気候プロット- ACN =周囲：縦のバーは±SE（注）を意味表す大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図3。総C、NおよびPサイクルの化学量論比酵素a）の Cと、b）N、およびc）P-PHACE用の0〜5センチメートルにおける実験及び5の両方の処置群の獲得に関与電位EEASの合計。 – 15cmの土壌の深さ。 V。EHN =上昇、CO 2と加熱プロット、気候プロット- ACN =周囲：erticalバーは±SE（注）を意味表す大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図4。総C、NおよびPサイクリング酵素活性のための酵素の化学量論酵素買収活動の化学量論比対照区におけるプレーリー暖房や高架のCO 2濃縮（PHACE）サイトで。（ACN：周囲の気候条件にさらさ）や治療法のプロット（EHN：温度上昇にさらされ、上昇したCO 2）。総土壌a）は、C：N、b）は、C：P及びc）N：Pが0〜5センチメートルおよび5〜15センチメートルの深さで土壌の両治療群についてプロットした。垂直バーは、平均値±標準誤差（注）を表しています。ACN=アンビエント-気候プロット; EHN =上昇、CO 2と加熱プロットは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図5。総C、NおよびPサイクル酵素の活性化エネルギーポテンシャルEEASの温度感受性合計a）の Cと、b）N、およびc）P分解酵素に対するアレニウスプロットを使用して表示;ならびにdの合計に対応する活性化エネルギー値）C 、E）N、およびF）、Pプレーリー暖房や高架のCO 2濃縮（PHACE）サイトでの処理プロットや土壌の深さの中で分解酵素。 ACN = A：活性化エネルギー（ すなわち DF）のために縦線が±SE（注）を意味表すmbient -気候プロット; EHN =上昇、CO 2と加熱プロット。出版物のためには、著者が、通常、アレニウスプロット（ すなわち AC）や活性化エネルギー値（ つまり DF）、両方ではなく、プロット·タイプのいずれかを提示することを選択するだろうことに注意することが重要である。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図6。総C、NおよびPサイクリング酵素Q10（15〜25°C）の温度合計a）の Cと、b）N 15°Cおよび25°Cで実験用のインキュベーションに基づいて、Q 10として測定電位EEASの感受性、およびプレーリー暖房や高架のCO 2 <での処理プロットや土壌の深さの中でC）、P分解酵素/サブ>エンリッチメント（PHACE）サイト。 Q10用の垂直バーは±SE（注）平均表しACN =アンビエント-気候プロットを、EHNは=上昇、CO 2と加熱プロット大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。