JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

תפוקה גבוהה fluorometric מדידה של קרקע פוטנציאלית פעילויות אנזים תאיות

Published: November 15, 2013
doi:
10.3791/50961
, , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering,University of Colorado

Summary

כדי למדוד את שיעורי פוטנציאל של פעילות אנזים תאית קרקע, מצעים סינטטיים המאוגדים צבע פלואורסצנטי מתווספים דגימות קרקע. פעילות אנזים נמדדה כצבע פלואורסצנטי משתחרר מהמצע על ידי תגובה-זרז אנזים, שבו הקרינה גבוהה יותר מצביעה יותר השפלה מצע.

Abstract

חיידקים בקרקעות וסביבות אחרות לייצר אנזימים תאיים לdepolymerize וhydrolyze מקרומולקולות האורגנית, כך שהם יכולים להיטמע לאנרגיה וחומרים מזינים. מדידת פעילות אנזים חיידקי אדמה היא קריטית בהבנת דינמיקה תפקודית מערכת אקולוגית בקרקע. הרעיון הכללי של assay אנזים הקרינה הוא שC-, הסינתטי N-, או מצעי P עשיר בכבול עם פלורסנט לצבוע מתווספים דגימות קרקע. כאשר שלם, מצעי שכותרתו לא לזרוח. פעילות אנזים נמדדה כגידול בקרינה כצבעי ניאון הם ביקע מהמצעים שלהם, המאפשר להם לזרוח. ניתן לבטא מדידות אנזים ביחידות של molarity או פעילות. כדי לבצע assay זה, slurries קרקע מוכן על ידי שילוב של אדמה עם חיץ pH. חיץ pH (בדרך כלל אצטט 50 מ"מ נתרן או 50 חיץ מ"מ טריס), נבחר לקבוע של החיץ מסוים חומצת דיסוציאציה (pKa) כדי להתאים את sa האדמה הטוב ביותרpH mple. Slurries האדמה מחוסן עם כמות nonlimiting של כותרתו מצע (כלומר C-, N-, או P-עשיר) fluorescently. שימוש slurries האדמה בassay משמש כדי למזער את המגבלות על אנזים ודיפוזיה מצע. לכן, בקרות assay זה להבדלים בהגבלת מצע, שיעורי דיפוזיה, ותנאי pH קרקע, ולכן איתור שיעורי פעילות אנזים פוטנציאל כפונקציה של ההבדל בריכוזי אנזים (לדוגמה).

מבחני אנזים הקרינה הם בדרך כלל רגישים יותר ממבחני spectrophotometric (כלומר colorimetric), אבל יכולים לסבול מהפרעות שנגרמו על ידי זיהומים וחוסר היציבות של תרכובות רבות ניאון כאשר הם נחשפים לאור, לכן נדרשת זהירות בעת הטיפול במצעי ניאון. כמו כן, בשיטה זו מעריכה רק את פעילות אנזים פוטנציאלית בתנאי מעבדה, כאשר מצעים לא מגבילים. יש להשתמש בזהירות בעת פירוש הנתונים המייצגים את הצלבאתר השוואות עם טמפרטורות שונות או סוגי קרקע, כמו בסוג קרקע באתר וטמפרטורה יכולות להשפיע על קינטיקה אנזים.

Introduction

אנזימים תאיים (וווים) המיוצרים על ידי חיידקי אדמה, פטריות, וקדום מעורבים בתהליכי biogeochemical רבים מספור, וממלא התפקיד מרכזי בעיבוד, ייצוב, ויציבות של חומר אורגני בקרקע ורכיבה על אופניים מזינים במערכות אקולוגיות יבשתית 1. על ידי הפקה וווים, חיידקים אדמה לפרק ולהפוך את חומר אורגני פולימרים למולקולות מסיסים קטנות יותר, ובכך משחררים מיקרו ואבות מזון קשורים בעבר, המאפשר לצמחים וחיידקים לקלוט חומרי מזון זמינים בקרקע. וווים נחקרו במשך עשרות שנים, בעיקר על ידי מדידת פעילותם במבחני מעבדה 2-4, מכיוון שקשה מאוד לזהות ולכמת באופן ישיר אנזימים.

פעילות תאית אנזים (EEA) נשלטת באופן חזק ביותר על ידי הריכוז של אנזימים ומצעים המתאימים. השפע של שונה C-, N-, ואנזימי P-משפילים בקרקעות נשלטים על ידי גורמים רבים including יומסה של חיידקים, הרכב קהילה, זמינות מצע, מיקרו אקלים, ודרישות stoichiometric 5,6. עם זאת, בEEAS אתרו בתוך סביבת הקרקע מושפעת גם מטמפרטורה 7,8, המחייב של אנזימים לטיט אדמה ומאפייני humic 2, ואילוצי דיפוזיה 9, אשר בסופו להסדיר את בריכת האנזים הפעילה, במונחים של גודל, זמינה מצע , ושיעורי תחלופה 10-12. לכן, הכרה בתנאי קרקע באתר היא קריטית בעת שימוש במבחני אנזים המעבדה לפרש פונקציה של חיידקים אדמה על פני אתרים סביבתיים שונים.

שיעורים רבים ושונים של EEA ניתן לכמת במבחני מעבדה תוך שימוש במגוון של מצעים סינטטיים (עיין "רשימה של ריאגנטים טבלה" לקבלת פרטים נוספים). פרוטוקולים מסוימים לנצל מצעים במבחנים שהם מצמידים לתגובת colorimetric שניתן לאתרם בספקטרופוטומטר, Wבשעה שהייתי. כולל הפרוטוקול שאנו מתארים כאן, לנצל את מצעים המאוגדים מחצית ניאון אחרים, מבחני EE הקרינה הם בדרך כלל רגישים יותר (על ידי סדר הגודל) מאשר מבחני colorimetric (אשר משתמשת במחצית chromogenic המקושרת עם מצע סינטטי) 12-14. רגישות בזיהוי EEA כוללת שני היבטים: האחד קשור לכמות של המתחם של עניין מזוהה ואחרת הקשורות לפעילות האנזים הנמוכה ביותר לגילוי הפוטנציאלית. שיטות לP-nitrophenol colorimetric ניתן למצוא מבחני מבוססי (PNP) בעבר עובד 15,16. בקיצור, אדמה (בדרך כלל הסתנן ל< 2 מ"מ והאוויר יבש) הוא טופח על pH טמפרטורה אופטימלי או בשדה רלוונטי. הקצב שבו מוצר התגובה שפורסם נקבע colorimetrically עם ספקטרופוטומטר 14. הרגישות גבוהה יותר של מבחני אנזים הקרינה נובעת בחלקו לזיהוי רגיש יותר של הפרדת מחצית fluorogenic קשורים substrאכלתי השפלה ולא ספיגת הקלטה לאחר הפרדת מחצית chromogenic ספציפית באורך גל מסוים. שני אינדיקטורים הניאון סינטטיים הנפוצים ביותר הם 4-methylumbelliferone (MUB) 17 ו7-אמינו-4-methylcoumarin (MUC) 18,19. מצעי MUC צמודים קשורים בדרך כלל עם מצעים סינטטיים N-עשירים כגון חלבונים ו / או חומצות אמינו. טכניקות פלורסנט פותחו לראשונה עבור דגימות מימית 20,21, והיישום שלהם לקרקעות דורש בקרות מרווית אות והפרעות 22,23. מבחני יכולים גם להתנהל באמצעות כימיה מסורתית "ספסל העליון" עם כמויות גדולות, או יכולים להיות מועסקים בפרוטוקולי microplate מבוססים, עם תפוקה מוגברת אבל אולי טעות מדידה גבוהה יותר. אמנם יש מספר פרוטוקולים שצוטטו בהרחבה לגילוי ניאון של EEAS בקרקעות 24, מעבדות רבות משתמשות בשינויים קלות על פרוטוקולים אלה, לעתים קרובות בטעות או עקב הבדלים בציוד מעבדה או חומרים כימיים. הבדלים קטנים לכאורה בפרטים של פרוטוקולים יכולים מאוד להשפיע נמדדו EEAS 25,26 וחוסר אנזימים סטנדרטיים עושה את זה מאתגר כדי לכייל מבחני בין מעבדות שונות. לפיכך, יש צורך חשוב להפצת פרוטוקולים מפורטים לעידוד סטנדרטיזציה של מבחני EEA.

בפרוטוקול שלנו, דגימות קרקע מוכנות על ידי שילוב של דגימות קרקע עם חיץ pH ומאחד עם בלנדר. אז slurries מחוסן עם כמות nonlimiting של כותרתו fluorescently C-, N-, או מצע P-עשיר, שנבחר בהתאם לשאלת המחקר הספציפית של עניין. שימוש slurries אדמה במבחני האנזים משמש כביקורת כדי למזער מגבלות דיפוזיה מצע. Moieties הניאון הם הרווה עד שהם הבקיעו מהמצעים שלהם, ואת פעילות ובכך אנזים יכולה להתגלות כצבע פלואורסצנטי משתחרר מהמצע בy-תגובה זרז אנזים. עוצמת הקרינה הגוברת בזמן משקפת את שיעור התגובה-זרז אנזים.

הרעיון הכללי של assay אנזים הקרינה הוא שהמצעים סינטטיים כרוכים במחצית fluorogenic (צבע פלואורסצנטי), מתווספים לדגימות קרקע 27. במהלך השפלה מצע-זרז אנזים, את הקשר בין שובר את צבע הניאון ואת המצע. צבע פלואורסצנטי שוחרר מהמצע משמש ככתוצאה מכך הערכה עקיפה של פעילות אנזים, וניתן לכמת באמצעות קורא microplate כדי לזהות את עוצמת הקרינה של הצבע. בקיצור, כימות הקרינה מושגת כצבע המשוחרר פולט אור באורך גל אחד לאחר קליטת אור עם אורך גל שונה. עוצמת הקרינה שתועדה על ידי קורא צלחת מסוגל גם עירור וגילוי. פעילות אנזים ניתן לכמת בהמשך מבוסס על conce ניאון הצבע הידועntrations של המצע (כלומר כמויות ידועות של מצע סינטטי הוסיפו לדגימות קרקע), יחד עם התייחסות עקומה דילול סטנדרטי של עוצמות הקרינה למחצית fluorogenic הספציפית של המצע בשימוש assay (כלומר 4-methylumbelliferone (MUB) או 7-אמינו -4-methylcoumarin (MUC)). (נא עיין בסעיף הפרוטוקול לפרטים ספציפיים על כימות פעילות אנזים).

מבחני אנזים אדמת מעבדה הם שימושיים להערכת תפקוד קהילת חיידקים, אבל יש כמה מגבלות טכניות שצריכים להכיר משתמשים 10. מבחני הקרינה יכולים לסבול מהפרעות שנגרמו על ידי זיהומים ו / או חוסר יציבות של תרכובות רבות ניאון כאשר הם נחשפים לאור, ולכן נדרשת זהירות בעת הטיפול במצעי ניאון 25. חלקיקי קרקע ו / או חומר אורגני באדמת slurries יכולים גם להפריע לעוצמות הקרינה, המכונים אפקט מרווה 26.יתר על כן, מבחני אנזים המעבדה מעריכים רק EEAS הפוטנציאלי בתנאי מעבדה. במבחני חוץ גופית למדוד EEAS בתנאים בהם פיזור מצע ושפע הוא nonlimiting. לכן, הנתונים שסופקו על ידי מבחני אלה לא יכולים להיות טוב לפרוקסי EEAS תחת בתנאי קרקע באתר 10. בסך הכל, פעילות אנזים היא מאוד שימושית עבור השוואות יחסי שבסוגי הקרקע דומים. עם זאת, בעת השימוש בשיטה זו כדי להשוות את פעילות בין קרקעות שונות בתכונות פיזיות או כימיות, יש להשתמש בזהירות. זאת בשל העובדה שהבדלים בסוג קרקע וטמפרטורה באופן דרסטי יכולים לשנות את המצב בקינטיקה אנזים באתרה. מגבלה נוספת היא שמספר קטן יחסית של מצעים זמינים מסחרי (בהשוואה לסביבה הטבעית). יתר על כן, מצעים סינטטיים המשמשים למבחני אנזים הם פשוטים יחסית (בקלות מסיסה) עלול שלא לייצג במדויק מצעי האדמה בהווה או בavailablדואר באתרם. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא כי באמצעות slurries אדמה יהיה לשלב את הפעילות של כמה אנזימים התייצבו (כלומר משותקים על ידי חומר או חרסית אורגני) שלא יכול להיות פעילה באתרו בתנאים 2. מבחני אנזים מעבדה גם לא מספקים מידע בנוגע להתמדה של אנזימים בקרקע (שיעורי תחלופת אנזים) או מידע לגבי המינים של חיידקים מסוימים שמייצרים אנזימי אדמה.

Protocol

1. Assay קמה תווית 3 צלחות גם עמוקות: "דוגמא", "MUB סטנדרטי", ו "סטנדרטי MUC". יוצקים כל תקן (MUB של 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, ו100 מיקרומטר) ומצע (BG, CB, לנדנד, Phos, XYL, AG, LAP) לתוך מאגרים נקיים נפרדים, prelabeled (אוריינטציה בשורות) . פיפטה סטנדרטית MUB המתאים לתוך בארות המקבילה צלחת MUB סטנדרטית (טבלה 1). פיפטה 200 μl של 0 MUB מיקרומטר לשורה של צלחת סטנדרטית MUB. פיפטה 200 μl של 2.5 מיקרומטר MUB לשורה ב 'של צלחת סטנדרטית MUB. פיפטה 200 μl 5 MUB מיקרומטר לתוך C השורה של צלחת סטנדרטית MUB. פיפטה 200 μl של 10 MUB מיקרומטר לD שורה של צלחת סטנדרטית MUB. פיפטה 200 μl של 25 MUB מיקרומטר לתוך E השורה של צלחת סטנדרטית MUB. פיפטה 200 μl של 50 MUB מיקרומטר לתוך השורה F של צלחת סטנדרטית MUB. פיפטה 200 μl של 100 μMUB M לשורת G של צלחת סטנדרטית MUB. חזור על השלבים 1.3.1 – 1.3.8 לסטנדרטי MUC לתוך בארות המתאימות הצלחת סטנדרטית MUC. slurries אדמה הכנה עבור כל דגימת קרקע. שוקל 2.75 גרם של אדמה לחה שדה לתוך בלנדר. הוספת 91 מיליליטר של 50 חיץ מ"מ. ערבב על גבוה דקות 1. יוצקים תוכן בלנדר לתוך קערת זכוכית נקייה לפחות רחבה ככל פיפטה 8 ערוצים עם בר ומערבב. מניחים על צלחת ומערבבים, לערבב תרחיף אדמה על נמוך. פיפטה 800 μl של תרחיף קרקע לעמודה ראשונה של הצלחת לדוגמא (טבלה 2). חזור ל1 עמודת st לסטנדרטים של MUB וצלחות MUC הסטנדרטי (טבלת 1). יש לשטוף את בלנדר מוט, צלחת ומערבבים ומערבבים עם DI H 2 O או חיץ בין דגימות קרקע. חזור על שלבים 1.4.1 – 1.4.7) עבור כל דגימה, עוברים לטור הבא עם כל דגימת קרקע שלאחר מכן (לוחות 1 ו2). פיפטה את המצע המתאים (בדוגמא זו, 200 מיקרומטר ריכוזים) לתוך בארות המתאימות הצלחת לדוגמא (טבלה 2). פיפטה 200 μl של מצע BG לשורה של צלחת לדוגמא. פיפטה 200 μl של מצע CB לשורה ב 'של צלחת לדוגמא. פיפטה 200 μl של מצע נאג לתוך C השורה של צלחת לדוגמא. פיפטה 200 μl של מצע Phos לD שורה של צלחת לדוגמא. פיפטה 200 μl של מצע XYL לE שורה של צלחת לדוגמא. פיפטה 200 μl של מצע AG לשורת F של צלחת לדוגמא. פיפטה 200 μl של מצע LAP לשורת G של צלחת לדוגמא. חזור על השלבים 1.5.1 – 1.5.7 לכל צלחת מדגם טמפרטורת דגירה. 2. דגירה של צלחות Assay לאטום את הצלחות עמוקות היטב ("דוגמא", "סטנדרטי MUB", ו "סטנדרטי MUC4 ;) עם מחצלות צלחת. הפוך כל צלחת (אטום) ביד עד לפתרון הוא מעורב באופן יסודי (~ 10x). הנח צלחות בחממה מתאימה לתקופת הנדרשת זמן דגירה (לוח 3). הקלט את הזמן ראשוני כשעה 0. גם להקליט פעמים הדגירה המתאימות, כך שאתה יודע מתי להסיר את הצלחת מן החממה (לוח 3). בסוף כל תקופת דגירה, צנטריפוגה הצלחות אטומות במשך 3 דקות ב ~ 2,900 x גרם. לאחר הסמכה, להעביר 250 μl מכל טוב של הצלחות גם עמוקות מודגרות לתוך בארות מקבילות בצלחות 96 היטב עם תחתית שטוחות שחורות (צלחת אחת שחורה תשמש לכל צלחת גם עמוקים מודגרות). חשוב להעביר דגימות מהצלחות גם עמוקות מודגרות לאותו בארות (כלומר A1 … A12, וכו ') בצלחות השחורות עם תחתית שטוחה 96 היטב (טבלת המס' 1, 2). 3. מדידות ניאון עלfluorometer Microplate בעקבות הוראות יצרן לקורא צלחת fluorometric משמש, להגדיר את אורך גל העירור ל365 ננומטר ואורך גל פליטה 450 ננומטר (או להשתמש במסננים מתאימים). קראו את שלוש צלחות על fluorometer. חשובות: דגימות וצלחות סטנדרטיות (כלומר MUB או MUC) יש לקרוא תוך שימוש באותו הרווח. הגדר את ספקטרופוטומטר לעלייה אוטומטית ולקרוא את צלחות MUC וMUB רגילה. רווח למצב ידני, ולהקטין את הערך מלהיות אופטימלי למספר הנמוך ביותר הבא, מעוגל לחמש הקרובים ביותר, לכל צלחת רגילה. חזור 2x לכל צלחת. קבע את הרווח לאוטומטי ולהפעיל את הצלחת לדוגמא. הפעל מחדש את הצלחת לדוגמא באופן ידני כדי להתאים את הרווח הגבוה ביותר עבור כל אחת מהצלחות רגילה (כלומר MUB וMUC). 4. ניתוח נתונים הזן את נתוני הקרינה עקומת סטנדרט לגיליון אלקטרוני לMUB (לוח 4 א) וסטנדרטי MUC (4 ב טבלה) המרת ריכוזים (מיקרומטר) עד (μmol) (4 א שולחנות ו -4). לנתוני הקרינה עקומת הסטנדרט של כל מדגם, לחשב את השיפוע, חיתוך-y, ו-R 2 ערכים עבור MUB וMUC (μmol) ריכוזים סטנדרטיים. R 2 ערכים מקובלים יעלה 0.98 עבור כל דגימה (4 א שולחנות ו -4). זה עשוי להיות שימושי כדי להמחיש עקומות סטנדרטיות בעלילה פיזור; עם הקרינה קורא זממה כמשתנה התלוי (ציר ה-Y) והריכוז סטנדרטי (μmol) זמם כמשתנה הבלתי תלויה (ציר x) (איור 1). תוכל להשתמש במדרון MUB וMUC הסטנדרטי עקום וערכי חיתוך-y לחישוב המדגם + נתוני הקרינה גלם מצע לEEAS פוטנציאלי. עליך להזין ראשון המדגם + נתוני הקרינה גלם מצע לתוך גיליון אלקטרוני חדש (לוח 5 א </strong>). אתה גם צריך להיכנס לזמן הדגירה (HR) ומשקל יבש אדמה עבור כל דגימה (5 ב טבלה). שים לב, בזמן הערכים שהוזנו בדוגמא זו הם 3 שעות, כי הדגימות הודגרו ב ° C25 (לוח 3). הפחת את הערכים ליירט עקומה סטנדרטיות מערכי הקרינה המדגם המקביל ולאחר מכן לחלק ידי שיפוע העקום המקביל הסטנדרטי (לוח 5 ג). כדי להשיג זאת, לסדר מחדש את משוואת קו רגילה לפתור למדגם ריכוז אנזים (x); x = (י.ב.) / מ 'שבו: = קריאת y [הקרינה מדגם גלם; b = ליירט מMUB או עקומת MUC תקן; מ' = שיפוע מMUB או עקומת תקן MUC]. הכפל μmol מדגם, מהצעד 4.3.1 לעיל, על ידי 91 מיליליטר (חיץ בשימוש בתרחיף אדמת נפח) (5D טבלה). מתקבל ערך הפרד בשלב 4.3.2 על ידי המדגם ספציפי זמן הדגירה ומסה יבשה אדמה (5e טבלה): AMT אנזים [. (& #956; mol) x 91 דגירה x מיליליטר (HR) x אדמה יבשה (ז) x 0.8 מיליליטר x 1,000] הערה: 0.8 מיליליטר הוא הנפח של תרחיף המשמש גם בכל אחד, ו -1,000 מתקן לכמות הקרקע בפועל בכל טוב. הכפל את הערך שהושג בשלב 4.3.3 על ידי 1,000 כדי לקבל את היחידות הרצויות (אדמה / hr היבש פעילות nmol / g) (5F טבלה).

Representative Results

מבחני אנזים יכולים לשמש כדי לכמת EEAS הפוטנציאלי וכדי להשוות את פעילות בין דגימות דומות. כאן, אנו מציגים תוצאות נציג ממחקר אקלים ניסיוני השוואת קרקעות שחוו תנאי סביבה אקלים (ACN) לקרקעות שנחשפו לCO 2 גבוה וטיפולי חימום (EHN) (איורים 2-6). כיסוי צמחים בכל החלקות היו אופייני לערבה הצפונית מעורבת דשא נשלטה על ידי דשא C4 Bouteloua gracilis (HBK) ל"ג. ושני C3 עשבים, Hesperostipa comata טרין וRupr. וPascopyrum smithii (Rydb.); על 20% מהצמחייה מורכב מsedges וforbs. ניתן למצוא מידע נוסף בנוגע לתיאור אתר ותחום עיצוב ניסיוני באזכור 28-30. קרקעות נאספו משני עומקים שונים (0-5 סנטימטר ו5-15 סנטימטר) בכל אחד ממגרשי הטיפול באמצעות ליבת 1.5 קוטר סנטימטר להעריך EEAS אדמה בתגובה לשינה ג האקליםonditions. בדוגמאות שלנו (כלומר איורים 2-6), גודל המדגם הוא (N = 3). ללא קשר לגודל מדגם מינימאלי זו, שונה הוא קטן יחסית, ברוב המקרים (כפי שהודגם על ידי הברים השגיאה) וחסון משקף השתנות בEEAS הפוטנציאלי בין חלקות טיפול. ניתוח שונות (ANOVA) ופוסט הוק השוואות מרובות Tukey שימש כדי לזהות שינויים משמעותיים בפעילות אנזים בין חלקות טיפול ומעמקי אדמה. תוצאות הנציג הבאות כבר סיפקו כדי להדגים כיצד תפוקה גבוהה זה, assay fluorometric יכול לשמש כדי לבדוק את (1) EEA הכללי בקרקעות, (2) איך stoichiometry EEA יכול להצביע על תהליכים ברמת מערכת אקולוגית ו( 3) מערכת היחסים בין טמפרטורת דגירה ואזור הכלכלי האירופי. EEA של אדמה הם בדרך כלל למדו להתייחס משמרות בתפקוד חיידקים לרכיבה על אופניים מזינים אדמה; אינדיקטורים שימושיים כדי להעריך דרישות תזונתית של חיידקים בתגובה לשינוי האקלים, קהילת צמח יםhifts, ואופן רחב יותר של מערכת אקולוגית מתפקד 31-33. stoichiometry EEA אומצה לאחרונה גם כמדד להערכה תזונתי רכיבה על אופניים ביוכימיים קרקע על ידי מצטלב תיאורית stoichiometric אקולוגית ותאוריה המטבולית של אקולוגיה על מנת להעריך חוסר איזון תזונתי של חיידקים פוטנציאליים המתאים לתנאי סביבה 5. מחקרים רבים הראו כי יחסי stoichiometric רחבים מעידים על מגבלות צמיחה תזונתית 34-36; והחומרים מזינים אדמה הפכו מוגבלים, חיידקים מגיבים על ידי הקצאת משאבי חילוף חומרים כדי לייצר אנזימים ספציפיים לרכישת חומרים מזינים חסרים 37. C Ecoenzymatic: חנקן: שיעורי stoichiometry P הם כך שימושיים לזהות משמרות יחסי בדרישות תזונתי קהילת חיידקים פוטנציאליות בתגובה להפרעות סביבתיות שונות 5. לבסוף, רגישויות טמפרטורה של EEAS יכולות להיות שימושיות כדי להעריך כיצד מגוון תפקודי קהילת חיידקי קרקע ודאי השפיע על ידי משמרות טמפרטורה <sup> 7,38. רגישויות טמפרטורת אנזים יכולות להשתנות במידה רבה בין קרקעות לאחת אנזים כיתה, וקהילות חיידקים בייצור אנזימים הראו שינויים בפעילות אנזים המתאימים לשינויים באקלים מהתנאים היסטוריים 7. לכן שאלות פעילות אנזים הקשורים לאקולוגית התרמית של וווים יכולות להיות דרך שימושית כדי להעריך את הדינמיקה פונקציונלית של חיידקים ותהליכים אקולוגיות מתחתיה בתגובה לאקלים משתנה 39,40. בדוגמא זו, פוטנציאל C-, N-, ופעילויות רכישת P-אנזים assayed ב 0-5 מעמקי אדמת סנטימטר לא היו שונות בטיפול ניסיוני (איור 2 א). עם זאת, במעמקי אדמת 5-15 סנטימטר, כמה EEAS פוטנציאל לא שונה באופן משמעותי (איור 2b). לדוגמא, אנזימי C-משפילים β-1 ,4-glucosidase וβ-D-cellobiohydrolase היו נמוכים יותר בחלקות EHN (p ≤ 0.038; איור 2b) בהשוואה לחלקות ACN. הכורה N ו-Palizing אנזימים (β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase וphosphatase, בהתאמה) היו נמוכים יותר בחלקות EHN (p ≤ 0.012; איור 2b) בהשוואה לACN ב5-15 מעמקי אדמת סנטימטר. חישוב והתוויית הסכום של כל C-, N-, או EEAS פוטנציאל רכיבה על אופניים-P יכול להיות גישה יעילה כדי לבחון דפוסים רחבים יותר בנוגע לפוטנציאל C-, קרקע זמין, ו / או P-מחזורים (איור 3). בדוגמא זו, הסכום של β-1 ,4-glucosidase, β-D-cellobiohydrolase, β-Xylosidase, וα-1 ,4-EEAS פוטנציאל glucosidase היה מחושב מייצג פעילויות רכיבה על אופניים C פוטנציאליות. הסכום של β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase וaminopeptidase L-לאוצין היה מחושב מייצג פעילויות רכיבה על אופניים N פוטנציאליות. Phosphatase שימש לייצג פעילויות רכיבה על אופניים P פוטנציאליות. בדוגמא זו, EEAS הפוטנציאל כולל C-, N-ו-P-רכיבה במגמה נמוך בEHN מגרשים בהשוואה לחלקות ACN ב5-15 מעמקי אדמת סנטימטר (figuמחדש 3). עם זאת, מגמה זו הייתה משמעותית רק עבור פעילויות הכוללת רכיבה על אופניים N ו-P (p ≤ 0.046; איור 3). EEAS אדמה לא היה שונה משמעותי בין חלקות הטיפול ב0-5 מעמקי אדמת סנטימטר (איור 3). הממצאים לדוגמא זו מצביעים על מגמות מנוגדות בקבוצה פונקציונלית אנזים הפעילות (כלומר C-, N-, או אנזימים משפילים-P) בין חלקות הטיפול (ACN לעומת EHN) בתגובה לעומק אדמה. לדוגמא, C-, N-וEEAS אדמת P-המשפיל בחלקות הסביבה (ACN) במגמה גבוה יותר בעומקים נמוכים יותר בהשוואה לקרקעות שנחשפו לCO 2 גבוה וחימום (EHN), שהפגין דפוס הפוך (3a-ג איור ). stoichiometry אנזים הוא גישה שימושית אחרת כדי להעריך את פעילות אנזים פוטנציאלית בסביבה (איור 4). הביקוש של חיידקים לחומרים מזינים נקבע על ידי stoichiometry היסודות של ביומסה חיידקים ביחס לסביבהזמינות חומרי הזנה 32. כמו כן, חיידקים מייצרים אנזימים מסוימים (כלומר C-, N-, או אנזימים משפילים-P) כדי לעמוד בדרישות תזונתית בתוך סביבות האדמה שלהם, המכונים גם stoichiometry האקולוגי 41. יחס EEAS הפוטנציאל הוא אחת דרכים להעריך דרישות תזונתית של חיידקים. לדוגמא, יחס של 1:1 בין שתי אנזים קבוצות פונקציונליות (לדוגמא ב-C: N רכישה תזונתית) הייתי מציע שהביקוש לN הוא גבוה ביחס לביקוש לC כאשר בוחנים C חיידקים ביומסה: N יחסים ברמת הקהילה הוא בדרך כלל 8:01 42. בדוגמא זו, C אנזים אדמת stoichiometry: N, C: P, או N: פעילויות שונות באופן משמעותי בין P חלקות הטיפול ב0-5 מעמקי אדמת סנטימטר (איורים 4 א ג). עם זאת, C פוטנציאל אנזים: P ו-N: יחסי P היו גבוהים יותר בEHN מגרשים בהשוואה לחלקות ACN במעמקי אדמת 5-15 סנטימטר (p = 0.05; 4b דמויות וג 4). תצפית זו מצביעה על כך שישהוא EEAS מינרליזציה P יחסית גבוה יותר בהשוואה ל-C ו-N EEA חלקות ACN (בהשוואה לEHN) בשעה 5-15 מעמקי אדמת סנטימטר. האנזים C: יחסי פעילות רכישת N הפגינו מגמה דומה לזו שהפגינה EEAS C המוחלט עם C גבוה יותר: לא זמין בשל EEAS גבוה יותר פוטנציאל C בחלקות ACN בעומק נמוך יותר בהשוואה לEHN (איור 4 א). טמפרטורה יכולה מאוד להשפיע EEAS אדמה. עם זאת, במבחני מעבדה טיפוסיים, אנזימי אדמה נמדדים בטמפרטורה אחת שאולי לא מתאימות לתנאי טמפרטורה באתרה. שיטת assay אנזים הקרינה שלנו מאפשרת לנו לשקול בהשפעות טמפרטורת אתרו על ידי שילוב של טמפרטורות דגירה מעבדה מרובות לשם השוואה. באמצעות incubations מעבדה בטמפרטורות מרובות מאפשר לנו לנתח נתונים קינטיקה אנזים טמפרטורה תלויה באמצעות עלילת ארניוס וQ 10 חישובים. עלילת ארניוס משמשות לדמיין אנרגיית שפעול, והם זממוing הלוגריתם של פעילות אנזים (משתנה תלוי ציר y) כפונקציה של הטמפרטורה ההפוכה להמרה למעלות קלווין (1 / K) על ציר ה-x (כלומר משתנה בלתי תלויה; דמויות 5a-C). אנרגיית שפעול מוגדרת בכינויו האנרגיה המינימלית הדרושה כדי לזרז תגובה כימית (כלומר בזות מצע נתון למוצרים קטנים יותר). למטרות שלנו, אנרגיית הפעלה משמשת כמדד לרגישות הטמפרטורה של תגובות אנזים זרז. אנרגיית שפעול גבוהה יותר מצביעה על רגישות טמפרטורת אנזים. כמו כן, אנרגיות הפעלה (כלומר דמויות 5D-f) ישירות מתאימות לQ 10 ערכים (כלומר דמויות 6a-C). ניתן למצוא הסבר נוסף של נוסחאות המשמשות לחישוב אנרגיית הפעלה ויישום מעשי רבים בעבר עובד 40,43-45. חלקות ארניוס, אנרגיית הפעלה, ו-Q 10 חלקות לספק מידע מיותר ולא צריךכל לשמש באותו כתב היד להציג את הנתונים לפרסום (איורים 5, 6). לכן, כאשר שימוש בטכניקות אלה, יש צורך לבחור את הסוג המתאים ביותר מגרש לטמפרטורת אנזימך – קינטיקה נתונים 10. כל סוגי העלילה (ארניוס וQ 10) הוצגו כאן לצורך הדגמה, כדי לספק דוגמאות חזותיות של איך להציג את תוצאות אנזים. בדוגמאות שלנו, אנו הערכנו קינטיקה אנזים פוטנציאל פוטנציאל C-, N-, ו-P-EEAS בין שני חלקות הטיפול בשני מעמקי האדמה (איור 5; איור 6). הממצא הראה כי רגישות הטמפרטורה של EEAS לא הייתה שונה משמעותי בין חלקות טיפול בבית או במעמקי אדמה לאנרגיית הפעלה כפי שמודגמים בחלקות ארניוס (איורים 5 א ג) ואנרגיות הפעלה מתאימה (DF איור) ו( שלא במפתיע) לש 10 אש"ףTS (בדוגמא זו בין 15 מעלות צלזיוס ו25 incubations המעבדה C °; איורים 6 א ג). הדבר מצביע על כך קינטיקה אנזים לא הושפעה מטיפולי שדה הניסוי במחקר המסוים הזה. טבלת 1. עיצוב צלחת גם עמוק לריכוזים סטנדרטיים הקרינה עם דגימות קרקע. תבנית לארגון ותקני הקרינה טעינה (MUB או MUC) עם דגימות קרקע לצלחת גם העמוקה לפני דוגרים. הערה: העמודות מייצגות את אותו דגימות הקרקע (800 μl של תוספות תרחיף אדמה). שיפוע של ריכוזים סטנדרטיים הקרינה טעון עבור כל שורה (200 נוספה μl). כל תא מייצג ריכוז סטנדרטי הקרינה בתוספת שנוספו תרחיף קרקע. לדוגמא, S1 – S12 מייצג דגימות קרקע (800 μl של תרחיף אדמה); MUB 0-100 מיקרומטר = 4-Methylumbelliferone ריכוזים (200 נוספו μl). בדוגמא זו, שורת H הוא פתוח, וכתוצאה מכך הוא זמין לכולל ריכוז סטנדרטי הקרינה גבוהה יותר במידת צורך. החלטה זו כדי להגדיל את ריכוזי עקומה סטנדרטיים עשויה להיות נחוצה לפעילות גבוהה יותר פוטנציאל אנזים (ו / או ריכוזי המצע בשימוש) עבור דגימות הקרקע הספציפיות שלך. פעילות אנזים הפוטנציאל לדגימות שלך צריכה ליפול בטווח של ערכי עקומה סטנדרטיים. לחץ כאן לקבלת לוח גדול יותר. טבלה 2. עיצוב צלחת גם עמוק לדגימות קרקע עם מצע. תבנית לארגון וטעינת דגימות קרקע ומצעים לצלחת גם העמוקה לפני דוגרים. הערה: העמודות מייצגות את אותו דגימות הקרקע (800 μl של כל כךנוספה slurry il). מצעים שונים נטענים על פני כל שורה (200 נוספו μl). כל תא מייצג דגימות קרקע בתוספת בנוסף מצע. לדוגמא, S1 – S12 מייצג דגימות ייחודיות אדמה (800 μl של תרחיף אדמה). מצעים (200 נוספו μl) כוללים: BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside; CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; נאג = 4-Methylumbelliferyl N-אצטיל-β-D-glucosaminide; Phos = 4-Methylumbelliferyl פוספט: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside; וLAP = hydrochloride L-לאוצין-7-amido-4-methylcoumarin. בדוגמא זו, שורת H הוא פתוח, וכתוצאה מכך הוא זמין לכולל מצע אחר להעריך אחר פעילות אנזים פוטנציאל אם תרצה בכך. לחץ כאן לקבלת לוח גדול יותר. טמפרטורה זמן 4 מעלות צלזיוס ~ שעה 23 15 ° C 6 שעות 25 ° C 3 שעות 35 ° C 1.5 שעות לוח 3. טמפרטורות חממה נדרש לתקופות מקבילות בזמן דגירה. טמפרטורות דגירה ופרקי זמן מקביל להליך assay האנזים. לוח 4. MUB וחישובי עקומת סטנדרט MUC. מדגים כיצד לארגן) MUB וב) נתוני הקרינה גלם MUC (μmol) כדי לחשב שיפוע, חיתוך-y, וערכי R בריבוע לאחר מכן. כדי לחשב את השיפוע, חיתוך-y, וערכי R בריבוע מעקומות הריכוז הרגילים שלך, בחר (או חלקה)MUB ו / או נתוני הקרינה גלם MUC כמשתנה התלוי (ציר ה-Y) וריכוז סטנדרטי (μmol) כמשתנה בלתי תלויה (ציר x). הערה:. MUB = 4-Methylumbelliferone; MUC = 7-אמינו-4 methylcoumarin-לחץ כאן לקבלת לוח גדול יותר. לוח 5. . חישובי פעילות אנזים מדגים כיצד) לארגן את נתוני הקרינה גלם מדגם ולאחר מכן לבצע את הצעדים דרושים (BF) כדי לחשב EEAS ל: קרקע / hr יבש פעילות μmol / g. הערה: S1 – S12 מייצג דגימות קרקע ייחודיות. מצעים כוללים: BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside; CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; נאג = 4-Methylumbelliferyl N-אצטיל-β-D-glucosaminide; Phos = פו 4-Methylumbelliferylsphate: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside; וLAP = hydrochloride L-לאוצין-7-amido-4-methylcoumarin. לחץ כאן לקבלת לוח גדול יותר. איור 1. עלילת עקומת סטנדרט MUB. ההדמיה Scatterplot של עקומות סטנדרטיות עם נתוני הקרינה גלם כמשתנה התלוי (ציר ה-Y) וריכוז סטנדרטי (μmol) כמשתנה בלתי תלויה (ציר x). איור 2. פעילות אנזים רכיבה על אופניים C, N ו-P. EEAS הפוטנציאלי בחימום בערבה והמוגבה CO 2 Enאתר richment (PHACE) בחלקות בקרה (ACN: נחשף לתנאי אקלים סביבה) וחלקות טיפול (EHN: נחשף לטמפרטורה עלתה וCO גבוה 2). אנזימי אדמה היו assayed ב) מעמקי אדמת 0-5 סנטימטר וב) מעמקי אדמת 5-15 סנטימטר. קווים אנכיים מייצגים את מתכוונים ± SE הערה: ACN = סביבה – חלקות אקלים; EHN = CO 2 גבוה ומגרשים חימום. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 3. סה"כ C, N ורכיבה על אופני P אנזים יחסי stoichiometric הסכום של EEAS הפוטנציאלי כרוך ברכישת) ג, ב) N, וג) P-בשתי קבוצות הטיפול בניסוי PHACE ב0-5 סנטימטר ו -5. – 15 אדמת סנטימטר מעמקים. Vברים ertical מייצגים מתכוונים הערה ± SE: ACN = סביבה – חלקות אקלים; EHN = CO 2 גבוה ומגרשים חימום. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 4. stoichiometry אנזים לC סך הכל, N, ופעילות אנזים רכיבה על אופניים P יחסי stoichiometric פעילות רכישת האנזים בחימום בערבה ומוגבה CO 2 העשרת אתר (PHACE) בחלקות בקרה. (ACN: נחשף לסביבת תנאי אקלים) וחלקות טיפול (EHN: נחשף לטמפרטורה עלתה ומוגבה CO 2). אדמה סה"כ) C: N, ב) C: P וג) N: P היה זמם בשתי קבוצות הטיפול ב0-5 סנטימטר ו5-15 מעמקי אדמת סנטימטר. קווים אנכיים מייצגים הערה ± SE ממוצעת: ACN= סביבה – חלקות האקלים; EHN = CO 2 גבוה ומגרשים חימום. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 5. . אנרגיות הפעלת אנזים רכיבה על אופניים סה"כ C, N ו-P רגישות טמפרטורה של EEAS הפוטנציאל מוצגת באמצעות חלקות עבור ארניוס כולל) C, ב) N, וג) P אנזימים משפילים; כמו גם את ערכי אנרגיית ההפעלה המתאימות לד סך הכל) C , ה) N, וו) P אנזימים משפילים בין חלקות טיפול ועומק אדמה בחימום בערבה ומוגבה CO 2 העשרת אתר (PHACE). קווים אנכיים לאנרגיית שפעול (כלומר DF) מייצגים מתכוונים הערה ± SE: ACN =mbient – חלקות האקלים; EHN = CO 2 גבוה ומגרשים חימום. לפרסום, זה חשוב לציין כי המחבר היה בדרך כלל לבחור להציג או חלקות ארניוס (כלומר AC) או ערכי אנרגיית שפעול (כלומר DF), אך לא את שניהם עלילת סוגים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 6. אנזים רכיבה על אופניים סה"כ C, N ו-P Q10 רגישויות (15-25 ° C). טמפרטורה של EEAS פוטנציאל נמדד כQ 10, המבוסס על incubations מעבדה ב15 מעלות צלזיוס ו25 מעלות צלזיוס במשך סך הכל) C, ב) N, ו ג) P אנזימים משפיל בין חלקות טיפול ועומק אדמה בחימום בערבה ומוגבה CO 2 <אתר / sub> ההעשרה (PHACE). קווים אנכיים לQ10 מייצגים מתכוונים הערה ± SE: ACN = סביבה – חלקות אקלים; EHN = CO 2 גבוה ומגרשים חימום. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Discussion

המדידה מבוססת המעבדה של EEAS אדמה הפוטנציאלי יכולה לספק תובנות חשובות תגובות חיידקים לסביבת אביוטי, והשלכותיהם על תפקוד מערכת אקולוגית. התוצאות של ערכת נתוני דוגמא זו מראות כי הבדלים מינימאליים קיימות בפעילות אנזים קרקע או קינטיקה בין חלקות טיפול האקלים. עם זאת, מגמות הפוכות בין חלקות יעודדו חקירה נוספת של משתנים שעשויים להשפיע על הייצור של EEAS חיידקים כגון רטיבות קרקע, pH קרקע או גידול צמחים. בסך הכל, הערכת EEAS במונחים של (1) EEA הכללי בקרקעות, (2) stoichiometry EEA (3) אנרגיית חלקות ארניוס / הפעלה, ו (4) ש 10 מספק קשת רחבה של גישות שיכולים להצביע על תהליכים ברמת המערכת האקולוגית שממנו לאפיין וחסונה דינמיקה תפקודית מערכת אקולוגית בקרקע.

מבחני EEA הקרינה מבוססת תפוקה גבוהה הם כלי שימושי שנמצא בשימוש נרחב כדי לבחון EEAS פוטנציאל בקרקעות וסביבות אחרות. חשוב לציין, פעילויות פוטנציאליות משקפות את גודל בריכת אנזים, אך לא על ידי עצמם לכמת שיעורי ייצור או למחזור אנזים 46. למרות הטכניקה היא פשוטה יחסית, הבדלים לכאורה בין קטין מעבדה פרוטוקולים יכולים לעכב את ההשוואה של תוצאות 13. למרבה הצער, אין לנו כרגע שולט חיובית סטנדרטית מתאימה לEEAS. השימוש ביחסי stoichiometric הוא גישה אחת להתגבר על אתגרים אלה. אחרת, כניסתו של טכניקות תפוקה גבוהה קידמה את המחקר של אנזימים בסביבה 4. פרשנות מדוקדקת של הנתונים המופקים על ידי מבחני אלה עשויות להבהיר את המגמות חשובות בפעילות חיידקים.

חוסנו של הפרוטוקול נובע מהיכולת לבחור לתנאים ספציפיים לדוגמאות בודדות, אבל זה יכול גם לגרום למגבלות. סדרה של שינויים שתידרש על מנת להבטיח דגימות נמדדות במדויק ל אתרי תחום פרט:

חוצץ

החיץ שתבחר יהיה תלוי ברמת החומציות של הקרקע. חציצה גם מייצבת את עוצמת הקרינה של הסטנדרטים הניאון, שהוא מאוד pH תלוי 27,47. חיץ pH, כי בדרך כלל אנו משתמשים על מנת להפוך את תרחיף האדמה הוא אצטט 50 מ"מ נתרן או חיץ טריס אשר נבחר לקבועה של החיץ מסוים חומצת דיסוציאציה (pKa) לאדמת ההתאמה הטובה ביותר – רמות ה-pH מדגם. נתרן אצטט יש pKa של 4.76, וטריס יש pKa של 8.06 כך הכמויות של שני מאגרים אלה ישתנו כדי להגיע pKa הרצוי למדגם הבודד. חיץ פוספט (pKa = 7.2) כבר הציע לקרקעות ניטרליות / מעט בסיסיות. עם זאת, אנו מזהירים לבדיקת השתנות אנליטיות במחקרים ראשוניים לפני השימוש במאגר הזה, כמו ריכוזי פוספט גבוהים עלולים להפריע לפעילות אנזים.

טיפול ואחסון של מצעי ניאון

jove_content "> מבחני הקרינה יכולים לסבול מהפרעות שנגרמו על ידי זיהומים ו / או חוסר יציבות של תרכובות רבות ניאון כאשר הם נחשפים לאור, ולכן נדרשת זהירות בעת הטיפול במצעי ניאון. אנו ממליצים בחום מזעור כל חשיפה לאור שלכותרתו fluorescently מצעים וMUB וסטנדרטים MUC . שימוש בבקבוקי זכוכית בצבע ענבר או כיסוי הזכוכית ומכולות המשמשת להכנת ואחסון מצעים וסטנדרטים ניאון מומלץ מאוד; רדיד אלומיניום לעטוף כלי זכוכית ומיכלי עובד היטב בדומה לכך, ביעילות ביחסינו צלחות והעברה לחממות כהות היא התרגול הטוב ביותר אנו ממליצים.. אחסון מצעים וסטנדרטים (-20 מעלות צלזיוס) במשך זמן רב יותר ללא מחודשיים (בזמן שהגנה עליהם מפני אור); ומצעי הפשרה (5 מעלות צלזיוס) ~ 24-48 שעה לפני תחילת assay האנזים (ים).

עיצוב ושכפול

לחשבון הטוב ביותר עבור גם לווריאציות מדגם כן, יישום Negativפקדי assay דואר ו( אם אפשר) assay משכפל מומלץ. וריאציה מתרחשת בדרך כלל כתוצאה מהבדלים בכמות חלקיקי אדמה בכל טוב ושגיאות pipetting. לכן, ערבוב חזק וטכניקת pipetting טובה באופן משמעותי לצמצם גם לוריאציה כן. יתר על כן, אנו ממליצים בחום יישום בקרה שלילית assay (חיץ + פתרון מצע) כדי לפקח על חוסר עקביות מצע לאורך זמן. זה יכול להיות במעקב בקלות בעת קריאת צלחות אנזים על ידי השוואת בארות בקרה שליליות (בדרך כלל אנו משתמשים בטור האחרון על צלחות 96 היטב). פקדי מצע שליליים הם בדרך כלל יציבים, ולכן מגביר את האות הרבה מעל גבול גילוי, זה מעיד על זיהום או חוסר יציבות מצע, הדורש החלפה של המצע ו / או פתרונות סטנדרטיים.

כדי למקסם את התפוקה, הפרוטוקול שלנו כולל מספר EEAS הפוטנציאלי בmicroplate גם עמוק אחת, למרות שפרוטוקולים אחרים לבצע סוג אחד שלassay לכל צלחת (כלומר מצע אחד לכל צלחת) מאז EEAS שונה מתרחש בקצב שונה. בכל מקרה, אנזים אופטימיזציה חייבת להתבצע על קרקעות לפני ביצוע גבוה זו גישה או גישת צלחת אחת לאורך כל דרך. מצעים מרובים ניתן להשתמש בצלחת אחת, אם שיעורי התגובה הם עקביים יחסית לכל אנזים בתוך תקופת הדגירה הזמן.

הפרוטוקול שלנו ממליץ ~ 2.75 אדמה גרם כדי להפוך את פתרון slurry, בעוד ~ 1 גרם מומלץ בפרוטוקולים אחרים 24. אנו מציעים כי באמצעות יותר אדמה (אם אפשר) הוא גישה יעילה ללכידה טובה יותר בתוך מדגם הווריאציה אדמה ברמות פעילות אנזים. בפרוטוקול זה, אנו דגירה 800 μl של תרחיף אדמה עם 200 מצע μl, בעוד שאחרים דגירה רק 200 μl של תרחיף אדמה עם 50 μl של מצעים. זה פשוט פונקציה של קנה מידה עד שסופו של דבר לא משנה את הפעילות הנמדדת. ישנם גם יתרונות מעשייםלשימוש בנפחים גדולים יותר. אחד, קל יותר, כדי למנוע חלקיקי אדמה תוך pipetting למתאים צלחות 96 היטב עם תחתית שטוחות שחורות לפני הקלטת עוצמות על fluorometer. שנית, הנפח נוסף הוא שימושי במקרה של דליפות מקריות בעת העברת הצלחות 96 היטב עם תחתית שטוחות השחורות לfluorometer לפני הקלטת עוצמות הקרינה הקשורות לאנזים. אפילו סטיות קלות בנפח באופן משמעותי תקטן הקרינה בין בארות. לבסוף, בשל אופי התפוקה הגבוה של פרוטוקול זה, שאנחנו בדרך כלל בוחרים להסתמך על שכפול ניסיון לייצג את השונות ברמות פעילות אנזים ולא ביצוע assay משכפל. זה תמיד להתאמן הכי טוב לכלול משכפל אנליטיים, אבל בפועל, אנחנו מרגישים הפרוטוקול שלנו מספק איזון מאוזן בין משכפל אנליטיות והניסיוני שניתן משאבים מוגבלים. כמו כן, הגישה שלנו משתמשת באדמה יחסית הומוגני יותר טוב (2.75 ז) לכל assay 25, אשר טבועהntly יורד בתוך אדמת וריאציות. ההחלטה להשתמש במשכפל אנליטיים יש לשקול בזהירות על ידי בדיקה לטעויות אנליטיות במחקרים ראשוניים 48. עם זאת, אנו ממליצים שעיצובים ניסיוניים עם פחות מ 4 חזרות לטיפול קבוצתיים צריכים מאוד לשקול שימוש assay משכפל.

קרקע, כרכי הצפת, ואופטימיזציה של ריכוז המצע

חיץ האדמה: יחס ריכוז מצע הוא משתנה חשוב שמשפיעה במידה רבה את הקרינה שנמדדה בעת ביצוע מבחני אנזים. כמות הקרקע בתרחיף הוסיפה לassay או ריכוז המצע ייתכן שיצטרך להיות מותאם בהתאם לפעילות של אנזימים בדגימת הקרקע. 44,4 הכמויות שנבחרו לדוגמא זו התבססו על בדיקות קודמות של קרקעות אלה כדי להבטיח שזמיני מצע nonlimiting, ושאנחנו מדידת שיעורי פוטנציאל מרביים בתנאי assay (מקסימום V)5. עם זאת, עבור דגימות קרקע שיש ריכוזים גבוהים של אנזימים, כמות של אדמה או ריכוז מצע חייבת להיות מוגברת. מצאנו כי הגדלת ריכוז מצע (והתאמת העקומה סטנדרטית בהתאם) יכולה להשפיע על הליניאריות של העקומה. לכן, אנו ממליצים לצמצם כמויות קרקע ו ​​/ או התאמות פרופורציונליות לחיץ כרכים במידת צורך. בכל מקרה, זה חשוב כדי לייעל את ריכוז מצע עבור כל סוג קרקע assayed בגלל EEAS נמדד יכול להיות שונה בכל סדר הגודל גדול יותר בין ריכוזי מצע הרוויים ותת רוויים 26. לכן הבדלים בין טיפולים ניסיוניים (וכו ') רגישים לסוג השני טעות סטטיסטית ופחות סיכוי להיות מזוהים בתנאים להרוות-Sub, ושגיאה סטטיסטית 27,35. כדי לייעל את ריכוזי מצע, מבחני אנזים ראשוניים צריכים להתבצע על דגימות קרקע נציג תוך שימוש במגוון רחב של ריכוזי מצע. לאחרהקלטת הקרינה, פשוט להתוות את הנתונים (בדומה לדוגמא העקומה הסטנדרטי; איור 1) כדי לזהות את ריכוז המצע (ציר x) מקביל לאנזים פעילות (ציר y) שבו הרמות מעל המדרון (~ 0). כמו כן, ריכוז המצע המתאים לנקודה שבה רמות המדרון מעל (~ 0) היא אינדיקציה טובה לריכוז המצע האופטימלי לקרקע מסוימת.

assay זה סופו של דבר מודד הקרינה לאורך זמן נתון המיוצר על ידי מחצית fluorogenic שהוא ביקע מן המצע כתוצאה מdepolymerization מצע בתיווך אנזים. לכן, שלב 5 (בנוסף מצע) הוא קריטי וחייב להתבצע ביעילות רבה ככל האפשר על מנת למזער את הזמן בין מועד בו המצע מתווסף לקרקעות וכאשר מבחני מודגרת. כמו כן, ברגע שהמצע בא במגע עם המדגם, תגובות אנזימטיות יתחילו להתרחש. אנו ממליצים להשתמש רב ערוציתפיפטה מסיבה זו. הוא מומלץ בחום ללהתייעל באמצעות פיפטה רב ערוצית לפני היום אתה מבצע מבחני האנזים שלך. כדי להשיג זאת, אתה יכול להתאמן pipetting עם מים עד שאתה יכול בקלות להעביר כרכים לתוך צלחות 96 היטב עם pipettor שלך.

אדמת מרווה

מרווה מתייחסת לירידה בעוצמת הקרינה הנגרמת על ידי חלקיקים ו / או חומר אורגני בslurries-incubations האדמה 26. מרווה יכולה להיות מושפעת על ידי התאמת האדמה: יחסי חיץ 25. בשל הקרינה רקע מדגימות בודדות, זה הוא קריטי כדי להפעיל סטנדרטים עם דוגמאות כדי להסביר את רקע הקרינה (מרווה). למרות שחלק מפרוטוקולים להשתמש בריכוז אחד לאחר הבדיקה כי האות היא ליניארי, אנו ממליצים בחום יישום שליטה להרוות סטנדרטית עבור כל דגימה לשליטה הטובה ביותר להשפעות של מרווה. הימנעות מלעשות זאת תגרום לדוכןעקומת ארד אינו ישימה למדגם, והערכה לא נכונה של פעילות האנזימטית. התוספת של תקנים לslurries קרקע אינה רגיש לזמן, כתוספת סטנדרטית אינה משפיעה על הקרינה הרקע של המדגם.

NaOH בנוסף

התוספת של NaOH משמשת בפרוטוקולים מסוימים כדי לייעל מדידות פעילות אנזים fluorometric בגלל הצבע פלואורסצנטי שוחרר מהמצעים סינטטיים מפגין הקרינה שיא ב-pH> 9.0 26,49. כאשר שוקל את ההצעה הזאת, ריכוז NaOH צורך pH תרחיף קרקע (כלומר ל-pH> 9) ישתנה בהתאם לאדמה בפרט וחיץ pH משמש 26. עם זאת, אחרים טוענים כי NaOH לא עשוי להיות נחוץ משום שעוצמת אות היא בדרך כלל גבוהה מאוד אפילו ב-pH נמוך יותר, וכי זה מציג מקור נוסף לשגיאת מדידה. לדוגמא, ההשפעה של תוספות NaOH בpH התרחיף וfluore כך MUB או MUCscence שינויים לאורך זמן 25. מצעים MUB קשורים הוכחו להפגין הקרינה מוגברת עקבית עבור 20 דקות הבאות נוספה NaOH לפני הרמות להתחדד, בעוד MUC הוכיח יציב ירד הקרינה עד 60 דקות 26. לכן, חשוב לבצע סטנדרטיזציה של הזמן בין בנוסף NaOH ומדידת הקרינה. לחלופין, אם רמות הקרינה הן במידה מספקת לזיהוי ללא בנוסף, ביצוע מבחני ללא הוספת NaOH הוצע כחלופה מקובלת באותה מידה 26.

טמפרטורה

רגישות טמפרטורה צריכה להילקח בחשבון כאשר מחליטים טמפרטורת דגירה. אם העניין העיקרי הוא הבנת קינטיקה אנזים, באמצעות שלוש או יותר טמפרטורות כפי שמודגם באמצעות חלקות ארניוס (בסעיף התוצאות) היא גישה חזקה. אם האתר לדוגמה יש טמפרטורה אופיינית נמוכה כגון אדמת אדמה קפוא, אז duration של דגירה ייתכן שיהיה הצורך הוארך כדי לאפשר לאנזימים להגיב בטמפרטורות הדגירה קרות יותר. בעוד קינטיקה אנזים המסורתית מצביעה על כך שעלייה בטמפרטורה צריכה לגרום לפעילות אנזים מוגברת, מצאנו כי אנזימים יכולים להיות אתר ספציפי במונחים של רגישות טמפרטורת 50. לכן, כדי להבין את פוטנציאל פעילות האנזים ספציפי לאתר זה קריטי, כי טמפרטורת דגירה ומשך להיות מותאם כדי לשקף ערכי אתר שדה.

מסקנה

וווים הם נהגים קריטיים של תהליכי biogeochemical בקרקעות, ולכן אנחנו צריכים להיות מסוגלים למדוד את פעילותם. ישנם אתגרים רבים למדידת EEAS בקרקעות, כולל הפרעה ועיכוב. למרות אתגרים אלו, פרוטוקולים סטנדרטיים (כמו זה המתואר כאן) יכול להיות מיושמים באופן אוניברסלי למדידת EEAS עבור מגוון רחב של אנזימים. למרות שזה די קל להפיק נתונים איכות הבאות פרוטוקולים אלה, בפירוש מחדש של נתונים אלה בהקשר אקולוגי דורש שיקול זהיר של מה שהמבחנים הללו באמת מדידה, ואיך EEAS בתנאי assay עשוי להיות שונה מאלה תחת בתנאים באתרה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרסום זה מומן על ידי האנזימים במחקר מחקר סביבת תיאום הרשת נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע בארה"ב (DEB # 1,021,559). מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע בארה"ב (DEB # 1,021,559), והמחלקה של משרד האנרגיה של מדע (מחקר הביולוגי וסביבתית) בארה"ב. כל דעות, ממצאים ומסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של הכותבים ואינם בהכרח משקפות את הדעות של NSF האמריקאי.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalogue number Comments
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) Sigma Aldrich M9766 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) Sigma Aldrich M3633 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) Sigma Aldrich M6018 Cellulose degradation
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) Sigma Aldrich L2145 Protein degradation
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) Sigma Aldrich M2133 Chitin degradation
4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) Sigma Aldrich M8883 Phosphorus mineralization
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) Sigma Aldrich M7008 Hemicellulose degradation
4-Methylumbelliferone (MUB) Sigma Aldrich M1381
7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) Sigma Aldrich A9891
50 mM Sodium acetate anhydrous buffer Fisher Scientific S210-500 acidic and neutral soils
50 mM Tris base buffer Fisher Scientific BP154-1 basic soils
Equipment
Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs Fisher Scientific 14-512-65 pipetting reservoir
Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel Fisher Scientific 13-684-265 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl
TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips USA Scientific 1112 – 1720 10 racks of 96 tips (960 tips)
Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. Fisher Scientific 11-100-100SH Lab disc magnetic stir plate
Waring blender Fisher Scientific 14-509-7P Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container
BRAND Dispensette III bottle-top dispensers Fisher Scientific 13-688-231 Dispenser; range: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltic pumps Fisher Scientific 13-683-7 Optional dispenser
Fisherbrand magnetic stir bar Fisher Scientific 1451363SIX Used to stirr soil slurry afer blending
Pyrex glass bowls World Kitchen 5304218 Pyrex 10 oz rimmed custard cup
Costar 96-well black solid plates Fisher Scientific 07-200-590 Used for plate reader step
Costar 96-well assay blocks Fisher Scientific 07-200-700 V-bottom; 2 ml; sterile
Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats Fisher Scientific 14-387-93 Sterile 96-well cap mat for square wells
Centrifuge equipped with holders for deep-well plates Thermo Scientific 3121 Centra-GP8 (this model is no longer available)
Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader Tecan 30016058 Plate reader (this model is no longer available)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. . Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O., Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. . Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. , (1999).
  15. Tabatabai, M. A., Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. . Methods of Soil Analysis. 2, 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER – MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151 (2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis – Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J., Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. , 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279 (1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79 (1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

Tags

Soil Extracellular Enzyme ActivitiesFluorometric MeasurementSoil Microbial Enzyme ActivityFluorescence Enzyme AssaySoil SlurriesFluorescently Labeled SubstratesPotential Enzyme ActivitySoil Ecosystem Functional DynamicsEnzyme Kinetics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca, J. D., Steinweg, J. M., McMahon, S. K., Wallenstein, M. D. High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities. J. Vis. Exp. (81), e50961, doi:10.3791/50961 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image