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Environment

Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Published: November 15, 2013
doi:
10.3791/50961
, , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering,University of Colorado

Summary

Um mögliche Raten des Bodens extrazelluläre Enzymaktivitäten zu messen, werden synthetische Substrate, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gebunden werden Bodenproben zugegeben. Die Enzymaktivität wird gemessen, wie der Fluoreszenzfarbstoff von dem Substrat durch eine Enzym-katalysierte Reaktion, in denen höhere Fluoreszenz zeigt mehr Substratabbau freigegeben.

Abstract

Mikroben in Böden und anderen Umgebungen produzieren extrazelluläre Enzyme zu Depolymerisation und Hydrolyse von organischen Makromolekülen, so dass sie für Energie und Nährstoffe aufgenommen werden können. Mess mikrobiellen Enzymaktivität ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis Ökosystem Boden funktionelle Dynamik. Das allgemeine Konzept der Fluoreszenz-Enzym-Assay ist, dass synthetische C-, N-oder P-reiche Substrate mit einem Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind an Bodenproben zugegeben. Wenn intakte, werden die markierten Substraten nicht fluoreszieren. Die Enzymaktivität wird als der Anstieg in der Fluoreszenz, da die Fluoreszenz-Farbstoffe sind von ihren Substraten, die sie fluoreszieren können gespalten gemessen. Enzymmessungen können in Einheiten von Molarität oder Aktivität ausgedrückt werden. Um diesen Test durchzuführen, werden Boden Aufschlämmungen durch Kombinieren Boden mit einem pH-Puffer hergestellt. Der pH-Puffer (typischerweise ein 50 mM Natriumacetat oder 50 mM Tris-Puffer), wird für bestimmte Säurekonstante (pKa) des Puffers, um am besten entsprechen den Boden sa gewähltmple pH-Wert. Die Boden Aufschlämmungen werden mit einer nicht beschränkenden Menge des fluoreszenz (dh C-, N-oder P-reich) markierten Substrat inokuliert. Mit Boden Slurries im Assay dient der Beschränkungen, die Enzym und Substrat Diffusions minimieren. Daher ist diese Testkontrollen für Unterschiede in Substrat Einschränkung Diffusionsraten und pH-Bedingungen Boden; somit Potentialerfassungs-Enzymaktivität Raten als eine Funktion der Differenz in der Enzym-Konzentrationen (pro Probe).

Fluoreszenz-Enzym-Assays sind in der Regel empfindlicher als spektrophotometrische (dh farbmetrischen)-Assays, kann aber von Störungen durch Verunreinigungen und der Instabilität der vielen fluoreszierenden Verbindungen, wenn sie Licht ausgesetzt erleiden, so ist Vorsicht geboten beim Umgang mit fluoreszierenden Substraten. Ebenso diese Methode beurteilt nur potentielle Enzymaktivitäten unter Laborbedingungen, wenn Substrate sind nicht einschränkend. Bei der Interpretation der Daten, die Quer ist Vorsicht gebotenOrt Vergleiche mit unterschiedlichen Temperaturen oder Bodenarten, wie in-situ-Bodentyp und Temperatur können Enzymkinetik beeinflussen.

Introduction

Extrazelluläre Enzyme (EBS) durch Bodenbakterien, Pilze, Archaeen und produziert in unzähligen biogeochemischen Prozessen beteiligt und sind von zentraler Bedeutung für die Verarbeitung, Stabilisierung und Destabilisierung von Humus-und Nährstoffkreislauf in terrestrischen Ökosystemen ein. Durch die Herstellung von AgE-, Boden-Mikroben zersetzt und verwandeln polymere organische Materie in kleinere lösliche Moleküle, wodurch die zuvor gebundenen Mikro-und Makronährstoffe, die Pflanzen und Mikroben zu Verfügung Nährstoffe aus dem Boden aufnehmen können befreien. EEs seit Jahrzehnten vorwiegend durch Messung ihrer Aktivitäten in Laborassays 2-4 untersucht worden, da es sehr schwierig ist, direkt zu erfassen und zu quantifizieren, Enzyme.

Extrazelluläre Enzymaktivität (EEA) wird am stärksten von der Konzentration der Enzyme und der entsprechenden Substrate gesteuert. Die Fülle an verschiedenen C-, N-und P-abbauenden Enzyme im Boden wird von zahlreichen Faktoren beeinflusst iEinschluss von mikrobieller Biomasse, Community-Zusammensetzung, Substratverfügbarkeit, des Mikroklimas und stöchiometrischen Anforderungen 5,6. Jedoch in situ EEA im Bodenumgebung auch durch Temperatur 7,8, die Bindung von Enzymen an Boden Tonen und Huminsäure Eigenschaften 2 und Diffusionsbeschränkungen 9, die letztlich zu regulieren den aktiven Enzympool beeinflusst in Bezug auf Größe, Verfügbarkeit Substrat und Fluktuationsraten 10-12. Daher Anerkennung in-situ-Bodenbedingungen ist kritisch, wenn mit Hilfe von Laborenzymtests der mikrobiellen Funktion über verschiedene Umwelt Websites zu interpretieren.

Viele verschiedene Klassen von EWR in Labor-Tests mit einer Vielzahl von synthetischen Substraten quantifiziert werden (siehe "Liste der Reagenzien Tabelle" für weitere Details). Einige Protokolle verwenden Substrate in Assays, die eine kolorimetrische Reaktion, die mit einem Spektrophotometer detektiert werden kann gekoppelt sind, während andere, darunter das Protokoll beschreiben wir hier nutzen Substraten, die zu einer fluoreszierenden Gruppe gebunden sind. Fluoreszenz-EE-Assays sind in der Regel empfindlicher (von einer Größenordnung) als farbmetrischen Tests (die eine chromogene Einheit mit einem synthetischen Substrat verbunden verwenden) 12-14. Empfindlichkeit in EWR-Erkennung beinhaltet zwei Aspekte: eine mit der Menge der Verbindung von zinsbezogenen erkannt und die andere im Zusammenhang mit der niedrigsten nachweisbaren Potential Enzymaktivität. Methoden zur kolorimetrischen P-Nitrophenol (PNP)-basierte Assays können in Vergangenheit gefunden werden, arbeitet 15,16. Kurz gesagt, wird bei optimaler Boden oder Feldrelevanten Temperatur-und pH inkubiert (typischerweise <2 mm und an der Luft getrocknet, gesiebt). Die Rate, mit der das Reaktionsprodukt freigesetzt wird kolorimetrisch mit einem Spektrophotometer 14 bestimmt. Die höhere Empfindlichkeit der Fluoreszenzenzymtests ist zum Teil aufgrund der empfindlicheren Nachweis des fluorogenen Einheit Trennung mit substr verbundenaß Abbau statt Aufzeichnungs Extinktion nach der Trennung von einem spezifischen chromogenen Einheit bei einer bestimmten Wellenlänge. Die beiden am häufigsten verwendeten synthetischen Fluoreszenzindikatoren sind 4-Methylumbelliferon (MUB) 17 und 7-Amino-4-Methyl (MUC) 18,19. MUC-gebundenen Substrate werden häufig mit N reichen synthetischen Substraten, wie Proteinen und / oder Aminosäuren zugeordnet. Leuchtstoff-Techniken wurden zuerst für Wasserproben 20,21 entwickelt, und ihre Anwendung auf Böden erfordert Kontrollen für die Signal Abschrecken und Störungen 22,23. Tests können entweder mit traditionellen "Werkbank" Chemie mit großen Mengen durchgeführt werden, oder in Mikroplatten-basierte Protokolle verwendet werden, mit einem erhöhten Durchsatz aber möglicherweise höhere Messfehler. Während es einige häufig zitierten Protokolle für die Fluoreszenzdetektion von EAD Böden 24, viele Labors verwenden subtile Variationen dieser Protokolle oft versehentlich oder aufgrund eines Unterschiedss in Laboreinrichtungen oder Reagenzien. Scheinbar kleine Unterschiede in den Details der Protokolle können stark gemessen EEA 25,26 beeinflussen und das Fehlen von standardisierten Enzyme macht es schwierig, Tests zwischen verschiedenen Labors kalibrieren. Somit besteht ein hoher Bedarf für die Verbreitung der detaillierten Protokolle, um die Standardisierung der EEA-Assays zu fördern.

In unserem Protokoll werden Bodenproben durch die Kombination von Bodenproben mit einem pH-Puffer und Homogenisieren mit einem Mischer hergestellt. Die Aufschlämmungen werden dann mit einem nicht-beschränkenden Menge des fluoreszenzmarkierten C-impft, N-oder P-Substrat reichen, abhängig von der speziellen Fragestellung von Interesse gewählt. Verwendung von Schlämmen in den Boden Enzymassays dient als Kontrolle zur Substratdiffusionsbeschränkungen minimiert. Die fluoreszierende Einheiten werden abgeschreckt, bis sie von ihren jeweiligen Substrate gespalten, und damit die Enzymaktivität nachgewiesen werden kann als der fluoreszierende Farbstoff aus dem Substrat freigesetzt bY eine Enzym-katalysierte Reaktion. Die Erhöhung der Fluoreszenzintensität über der Zeit reflektiert die Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion.

Das allgemeine Konzept der Fluoreszenz-Enzym-Assay ist, dass synthetische Substrate, die mit einem fluorogenen Gruppierung (Fluoreszenzfarbstoff) gebunden sind, werden Bodenproben 27 aufgenommen. Während der enzymkatalysierten Substratabbau, bricht die Bindung zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Substrat. Der Fluoreszenzfarbstoff von dem Substrat freigesetzt wird folglich als eine indirekte Bewertung der Enzymaktivität verwendet wird, und kann unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät, um die Fluoreszenzintensität des Farbstoffs zu erfassen quantifiziert werden. Kurz gesagt, wird die Fluoreszenz Quantifizierung erreicht, wie der freigesetzte Farbstoff emittiert Licht einer Wellenlänge nach Absorption von Licht mit einer anderen Wellenlänge. Die Intensität der Fluoreszenz wird von einem Plattenlesegerät für sowohl Anregung und Detektion aufgezeichnet. Enzymaktivität kann anschließend auf der Grundlage der bekannten Fluoreszenzfarbstoff conce quantifiziertntrations des Substrats (dh bekannte Mengen an synthetischen Substrat Bodenproben hinzugefügt) mit Bezugnahme auf eine Standardverdünnungskurve der Fluoreszenzintensitäten für die spezifischen fluorogenen Gruppierung der im Assay (dh 4-Methylumbelliferon (MUB) oder 7-Amino verwendete Substrat -4-Methyl (MUC)). (Bitte beachten Sie die Protokollabschnitt für spezifische Details auf die Enzymaktivität Quantifizierung).

Laborbodenenzymtests sind nützlich für die Beurteilung der mikrobiellen Gemeinschaft Funktion, aber es gibt einige technische Einschränkungen, die Nutzer sollten 10 zu erkennen. Fluoreszenz-Assays können vor Störungen durch Verunreinigungen und / oder Instabilität vieler fluoreszierenden Verbindungen, wenn sie Licht ausgesetzt erleiden, so ist Vorsicht bei der Handhabung fluoreszierende Substrate 25. Bodenpartikel und / oder organische Material in den Boden Aufschlämmungen können auch mit Fluoreszenzintensitäten als Löscheffekt 26 bekannt stören.Außerdem Labor Enzymtests beurteilt nur potenzielle EEA unter Laborbedingungen. In-vitro-Tests messen EEA unter Bedingungen, wo Substrat Diffusion und Fülle ist nicht einschränkende. Daher können die Daten, die von diesen Tests vorgesehen nicht ein guter Proxy für EAD unter in-situ Bodenbedingungen 10. Insgesamt ist die Enzymaktivität sehr nützlich für relative Vergleiche, in denen Bodenarten ähnlich sind. Wenn jedoch diese Methode, um Aktivitäten zwischen Böden, die in physikalischen oder chemischen Eigenschaften unterscheiden zu vergleichen, ist Vorsicht geboten. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Unterschiede in der Bodentyp und der Temperatur kann der Zustand der in situ Enzymkinetik drastisch verändern. Eine weitere Einschränkung ist, dass relativ wenige Substrate sind im Handel erhältlich (im Vergleich zu der natürlichen Umgebung). Darüber hinaus sind die synthetischen Substraten für Enzymtests verwendet relativ einfachen (leicht löslich) nicht genau stellen die gegenwärtigen oder availabl Bodensubstratene in situ. Ein weiterer Faktor ist, dass die Verwendung von Boden Schlämmen wird die Aktivität einiger Enzyme stabilisiert (dh von organischer Substanz oder Tone immobilisiert), die nicht aktiv sein können unter in-situ Bedingungen 2 zu integrieren. Laborenzymtests auch nicht bieten Informationen über das Fortbestehen der Enzyme im Boden (Enzymumsatzraten) oder Informationen zu den spezifischen mikrobiellen Spezies, die Herstellung von schmutz Enzyme.

Protocol

1. Assay-Set-up Label 3 Deep Well Platten: "Sample", "MUB Standard" und "MUC-Standard". Gießen Sie jede Norm (MUB von 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, und 100 uM) und Substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) in separate sauber, vormarkiert Speichern (in Reihen orientiert) . Pipettieren Sie die entsprechende MUB Standard in entsprechende Vertiefungen der MUB Standardplatte (Tabelle 1). Je 200 ul von 0 uM MUB in Zeile A der MUB Standardplatte. Je 200 ul von 2,5 uM MUB in Reihe B der MUB Standardplatte. Je 200 ul von 5 uM MUB in Zeile C der MUB Standardplatte. Je 200 ul 10 uM MUB in Reihe D der MUB Standardplatte. Je 200 ul 25 uM MUB in Zeile E der MUB Standardplatte. Je 200 ul 50 uM MUB in Zeile F der MUB Standardplatte. Je 200 ul von 100 μM MUB in Reihe G der MUB Standardplatte. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 – 1.3.8 für MUC-Standards in entsprechende Vertiefungen der MUC Standardplatte. Prep Boden Schlämme für jede Bodenprobe. Wiegen 2,75 g Feld feuchten Boden in den Mixer. Hinzufügen 91 ml 50 mM Puffer. Mischung auf hoch für 1 min. Gießen Mixer Inhalt in einen sauberen Glasschale mindestens so breit wie 8-Kanal-Pipette mit einem Rührstab. Legen Sie auf Rührplatte mischen Bodenschlamm auf niedrig. Pipette 800 ul von Bodenschlamm in eine erste Spalte der Musterplatte (Tabelle 2). Wiederholen Sie in 1. Spalte der MUB-Standard und MUC-Standard-Platten (Tabelle 1). Spülen Mixer, rühren Platte und Rührstab mit DI H 2 O oder Puffer zwischen Bodenproben. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 – 1.4.7) für jede Probe in die nächste Spalte mit jeder nachfolgenden Bodenprobe (Tabellen 1 und2). Pipettieren, die das geeignete Substrat (in diesem Beispiel 200 &mgr; M Konzentrationen) in die entsprechenden Wells der Probenplatte (Tabelle 2). Je 200 ul der BG Substrat in Reihe A der Probenteller. Je 200 ul CB Substrat in Reihe B der Probenteller. Je 200 ul NAG Substrat in Zeile C der Probenteller. Je 200 ul von PHOS Substrat in Reihe D der Probe Platte. Je 200 ul XYL Substrat in Zeile E der Probe Platte. Je 200 ul AG Substrat in Reihe F des Probenteller. Je 200 ul der LAP Substrat in Reihe G der Probenteller. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1 – 1.5.7 für jedes Bruttemperatur Probenplatte. 2. Inkubation der Testplatten Verschließen Sie die Deep-Well-Platten ("Sample", "MUB Standard" und "MUC-Standard4 ;) mit Platte Matten. Kehren Sie jedes (versiegelt) Platte von Hand, bis die Lösung gründlich gemischt (~ 10x). Platzieren Platten in geeigneten Inkubator für die Inkubation erforderliche Zeit (Tabelle 3). Nehmen Anfangszeit als Zeit 0. Auch notieren die entsprechenden Inkubationszeiten, so dass Sie wissen, wann man die Platte aus dem Inkubator (Tabelle 3) zu entfernen. Am Ende jeder Inkubationsperiode Zentrifuge die versiegelten Platten für 3 min bei 2.900 x g ~. Nach der Zertifizierung, Transfer 250 ul von jedem der gut inkubiert Deep Well Platten in entsprechende Vertiefungen in schwarz mit flachem Boden 96-Well-Platten (eine schwarze Platte wird für jeden inkubiert tiefen Brunnen Platte verwendet werden). Es ist wichtig, Proben aus den inkubiert Deep Well Platten in den gleichen Brunnen (dh A1 … A12, etc.) in den schwarzen Flachboden-96-Well-Platten übertragen (Tabelle 1, 2). 3. Leuchtstoff-Messungen anein Mikro Fluorometer Nach Angaben des Herstellers für die fluorimetrische Plattenlesegerät verwendet wird, stellen die Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge 450 nm (oder entsprechende Filter). Lesen Sie die drei Platten auf dem Fluorometer. Wichtig: Proben-und Standard-Platten (dh MUB oder MUC) müssen mit dem gleichen Gewinn zu lesen. Stellen Sie die automatische Verstärkungs Spektralphotometer und lesen Sie die MUC und MUB Standard-Platten. Set Verstärkung auf manuell, und verringern Sie den Wert nicht optimal auf die nächste niedrigste Zahl, gerundet auf die nächsten fünf, für jede Standardplatte. Repeat 2x für jede Platte. Stellen Sie die Verstärkung, um die automatische und führen Sie den Probenteller. Führen Sie den Probenteller manuell auf den höchsten Gewinn für jede der Standard-Platten (dh MUB und MUC) entsprechen. 4. Datenanalyse Geben Standardkurve Fluoreszenzdaten in Tabellenkalkulations für MUB (Tabelle 4a) Und MUC-Standard (Tabelle 4b) Konvertieren (uM) Konzentrationen (&mgr; mol) (Tabelle 4a und 4b). Für Standardkurve Fluoreszenzdaten jeder Probe, die Berechnung der Steigung, y-Achsenabschnitt, und R 2-Werte für MUB und MUC (umol) Standardkonzentrationen. R 2 akzeptablen Werte 0,98 für jede Probe betragen (Tabelle 4a und 4b). Es kann nützlich sein Standardkurven in einem Streudiagramm zu visualisieren, mit Fluoreszenz liest als abhängige Variable (y-Achse) und Standardkonzentration (mmol), aufgetragen als unabhängige Variable (x-Achse) (Abbildung 1) aufgetragen. Sie werden die MUB und MUC Standardkurve Steigung und y-Achsenwerte verwenden, um die Probe + Substrat Rohstoffe Fluoreszenzdaten in potentielle EEA berechnen. Sie müssen zuerst die Probe + Substrat Roh-Fluoreszenz-Daten in eine neue Tabelle geben (Tabelle 5a </strong>). Sie müssen auch die Inkubationszeit (hr) und Bodentrockengewicht für jede Probe (Tabelle 5b) eingeben. Beachten, die in diesem Beispiel eingegebene Zeit-Werte von 3 Stunden, da die Proben wurden bei 25 ° C (Tabelle 3) inkubiert. Subtrahieren Sie die Standardkurve Schnittwerte aus den entsprechenden Probenfluoreszenzwerte und dann teilen durch die Steigung der entsprechenden Standardkurve (Tabelle 5c). Um dies zu erreichen, ordnen Standardgleichung für Probe Enzymkonzentration (x) zu lösen, x = (yb) / m, wo: [y = raw Leseprobe Fluoreszenz, b = Achsenabschnitt von MUB oder MUC Standardkurve, m = Steigung von MUB oder MUC Standardkurve]. Multiplizieren Probe mmol, von Schritt 4.3.1, um 91 ml (Puffervolumen im Boden Gülle) (Tabelle 5d). [Enzym amt: Teilen Wert in Schritt 4.3.2 von der Probe spezifischen Inkubationszeit und trockenen Bodenmasse (Tabelle 5e) erhalten. (& #956; mol) x 91 ml x Inkubation (h) x trockenen Boden (g) x 0,8 ml x 1.000] Anmerkung: 0,8 ml das Volumen der Aufschlämmung in jede Vertiefung eingesetzt, und 1000 korrigiert die tatsächliche Bodenmenge in jeder Vertiefung. Multiplizieren Sie die in Schritt 4.3.3 von 1000 erhalten, um die gewünschten Einheiten (nmol Aktivität / g trockenen Boden / h) (Tabelle 5f) Wert bekommen.

Representative Results

Enzymtests verwendet werden, um potenzielle EEA zu quantifizieren und Tätigkeiten unter ähnlichen Proben zu vergleichen. Hier stellen wir repräsentative Ergebnisse aus einer Studie zum Vergleich von experimentellen Klima Böden, die Umgebungsklimabedingungen (ACN) auf Böden, die zu erhöhten CO 2-und Heizungsanwendungen (EHN) (Abbildungen 2-6) ausgesetzt waren, erlebt. Pflanzendecke in allen Parzellen waren charakteristisch für eine nördliche Mischgrasprärie von der C4 Gras Bouteloua gracilis (HBK) dominiert Lag. und zwei C3 Gräser, Hesperostipa comata Trin und Rupr. und Pascopyrum smithii (Rydb.), etwa 20% der Vegetation wird von Seggen und Stauden zusammen. Mehr Informationen über die Site-Beschreibung und Feldversuchsdesign kann in 28-30 Referenzen gefunden werden. Böden wurden aus zwei verschiedenen Tiefen (0-5 cm und 5-15 cm) in jeder der Behandlungsstücke mit einem Durchmesser von 1,5 cm in den Boden EEA Kern in Reaktion auf veränderte Klima c beurteilen gesammeltenie Bedingungen. In unseren Beispielen (dh Fig. 2-6) ist die Probengröße (n = 3). Unabhängig von dieser minimale Probenmenge, die Variation relativ gering in den meisten Fällen (wie durch Fehlerbalken gezeigt) reflektiert und robust Schwankungen im Potential zwischen den Behandlungs EEA Parzellen. Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey post-hoc-Mehrfachvergleiche wurden verwendet, um signifikante Veränderungen in der Enzymaktivität zwischen den Behandlungsgrundstücke und Bodentiefen zu identifizieren. Die folgenden Ergebnisse wurden repräsentativ zur Verfügung gestellt, um zu zeigen, wie diese Hochdurchsatz, fluorimetrischen Test kann verwendet werden, um (1) Gesamt EWR in Böden zu testen, (2), wie EWR-Stöchiometrie kann ein Anzeichen von Ökosystemebene Prozesse und (3) die Beziehung zwischen Bruttemperatur und im EWR. Boden EUA werden häufig untersucht, um Veränderungen in der mikrobiellen Funktion zu Boden Nährstoffkreislauf beziehen, nützliche Indikatoren für mikrobielle Nährstoffansprüche in Reaktion auf den Klimawandel, Pflanzengemeinschaft s bewertenhifts, und im weiteren Sinne Ökosystemfunktionen 31-33. EWR-Stöchiometrie wurde vor kurzem als Index für biochemische Bodennährstoffkreislauf durch sich kreuzende ökologische stöchiometrischen Theorie und metabolische Theorie der Ökologie, um potenzielle mikrobielle Nährstoffungleichgewichten entsprechenden Umweltbedingungen 5 bewerten beurteilen angenommen. Zahlreiche Studien haben ergeben, dass breite stöchiometrischen Verhältnisse weisen auf Nährstoffwachstumsgrenzen 34-36, und als Nährstoffe im Boden werden begrenzt, Mikroben reagieren durch die Zuweisung metabolischen Ressourcen zu spezifischen Enzymen mangel Nährstoffe 37 erwerben zu produzieren. Ecoenzymatic C: N: P-Stöchiometrie Verhältnisse sind daher nützlich, um eine relative Verschiebungen in potenziellen mikrobiellen Gemeinschaft Nährstoffansprüche in Reaktion auf verschiedene Umwelt Störungen identifizieren 5. Schließlich können Temperaturempfindlichkeiten der EEA nützlich, um zu beurteilen, wie mikrobiellen Gemeinschaft Funktionsvielfalt wird wahrscheinlich durch Temperaturschwankungen beeinflusst sein <sup> 7,38. Enzyme Temperatur Empfindlichkeiten kann stark variieren zwischen Böden für eine einzelne Enzymklasse und Herstellung mikrobieller Gemeinschaften Enzyme Veränderungen in der Enzymaktivität entsprechend Verschiebungen im Klima von den historischen Bedingungen 7 demonstriert. So Enzymaktivität Fragen der thermischen Ökologie der AgE Zusammenhang kann eine nützliche Methode, um mikrobielle funktionelle Dynamik und unterirdischen Ökosystemprozesse in Reaktion auf Klimaänderungen zu beurteilen 39,40 sein. In diesem Beispiel potentielle C-, N-und P-Enzym-Erfassungsaktivitäten in 0-5 cm Bodentiefe untersucht nicht durch experimentelle Behandlung (Fig. 2a) unterscheiden. Doch 5-15 cm Bodentiefe, mehrere potenzielle EEA hat wesentlich unterscheiden (Abbildung 2b). Zum Beispiel können die C-abbauenden Enzyme β-1 ,4-Glucosidase und β-D-Cellobiohydrolase waren niedriger in den EHN Stücke (p ≤ 0,038, 2b) im Vergleich zu den ACN Parzellen. Die N-und P-Bergmannalizing Enzyme (β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase und Phosphatase), wurden auch in den unteren EHN Plots (p ≤ 0,012; 2b) im Vergleich zu ACN 5-15 cm Bodentiefe. Berechnung und Darstellung die Summe aller C-, N-oder P-Radfahren Potenzial EAD einen sinnvollen Ansatz, um breitere Muster in Bezug auf mögliche Boden C-, N-und / oder P-Zyklen (Abbildung 3) zu beobachten. In diesem Beispiel wurde die Summe von β-1 ,4-Glucosidase, β-D-Cellobiohydrolase-, β-Xylosidase und α-1 ,4-Glucosidase Potential EEA berechnet Potenzial C Radfahren Aktivitäten darstellen. Die Summe von β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase und L-Leucin-Aminopeptidase wurde berechnet, um potentielle N Radfahren Aktivitäten darstellen. Phosphatase wurde verwendet, um potenzielle P Radfahren Aktivitäten darstellen. In diesem Beispiel EEA Potenzial für Gesamt-C-, N-und P-Radsport tendierten niedriger in der EHN Grundstücke im Vergleich zu den ACN Grundstücke an den 5-15 cm Bodentiefe (Figure 3). Allerdings war dieser Trend nur für die Gesamt-N-und P-Rad-Aktivitäten signifikant (p ≤ 0,046; Abbildung 3). Boden EEA nicht signifikant zwischen den Behandlungsgrundstücke unterscheiden sich in 0-5 cm Bodentiefe (Abbildung 3). Die Ergebnisse für dieses Beispiel vorschlagen, kontras Trends im Enzym-Aktivität funktionelle Gruppe (dh C-, N-oder P-abbauende Enzyme) unter den Behandlungsgrundstücke (ACN vs EHN) in Reaktion auf Bodentiefe. Zum Beispiel, C-, N-und P-abbauenden Boden EEA in den Umgebungsgrundstücke (ACN) tendierten höher bei geringeren Tiefen im Vergleich zu Böden zu erhöhten CO 2 und Heizung (EHN), die eine umgekehrte Muster (Abbildung 3a-c gezeigt, ausgesetzt ). Enzyme Stöchiometrie ist ein weiterer sinnvoller Ansatz, um mögliche Enzymaktivitäten in der Umwelt (Abbildung 4) zu beurteilen. Die mikrobielle Nährstoffbedarf wird durch die Elementar Stöchiometrie der mikrobiellen Biomasse in Bezug auf Umwelt bestimmtNährstoffverfügbarkeit 32. Ebenso Mikroben produzieren spezifische Enzyme (zB C-, N-oder P-abbauende Enzyme), um die Nährstoffanforderungen innerhalb ihrer Boden-Umgebungen, die auch als ökologische Stöchiometrie 41 genannten entsprechen. Das Verhältnis der Potential EEA ist ein Weg, um mikrobielle Nährstoff Anforderungen zu beurteilen. Zum Beispiel, ein 1:1-Verhältnis zwischen zwei Enzym funktionellen Gruppen (zB in C: N-Nährstoffübernahme) würde vorschlagen, dass die Nachfrage nach N hoch im Vergleich zu der Nachfrage nach C ist, wenn man die mikrobielle Biomasse C: N-Verhältnisse auf Gemeindeebene 42 ist typischerweise 8:1. In diesem Beispiel Erde Enzym Stöchiometrie C: N: C: P oder N: P-Aktivitäten deutlich zwischen den Behandlungsstücke unterscheiden in 0-5 cm Bodentiefe (Fig. 4a-c). Jedoch potenzielle Enzym C: P und N: P-Verhältnisse waren höher in der EHN Stücke im Vergleich zu den ACN Stücke an den 5-15 cm Bodentiefe (p = 0,05, Fig. 4b und 4c). Diese Beobachtung legt nahe, dass esist relativ höheren P-Mineralisierung EEA im Vergleich zu C-und N-EWR die ACN Grundstücke (im Vergleich zu EHN) an den 5-15 cm Bodentiefe. Enzym-C: N-Verhältnisse Nahmen zeigten eine ähnliche Tendenz zu, dass durch die Gesamt-C EEA mit höheren C gezeigt: N aufgrund der höheren Potenzial C EEA in den ACN Grundstücke an der unteren Tiefe im Vergleich zu EHN (Abbildung 4a). Die Temperatur kann stark beeinflussen Boden EEA. Noch im typischen Labortests, Boden Enzyme bei einer einzigen Temperatur, die nicht in situ Temperaturbedingungen entsprechen können, gemessen. Unsere Fluoreszenz-Enzym-Assay-Methode ermöglicht es uns, in-situ-Temperatureffekte durch die Einbeziehung mehrerer Labor Inkubation Temperaturen zum Vergleich zu betrachten. Mit Labor Inkubationen bei mehreren Temperaturen ermöglicht es uns, zu analysieren temperaturabhängige Enzymkinetik Daten mit Arrhenius und Q 10 Berechnungen. Arrhenius werden verwendet, um die Aktivierungsenergie zu visualisieren, und werden uns aufgetragenten des Logarithmus der Enzymaktivität (y-Achse abhängige Variable) als eine Funktion der inversen Temperatur in Grad Kelvin (1 / K) auf der x-Achse umgewandelt (dh unabhängige Variable ist, Fig. 5a-c). Aktivierungsenergie wird allgemein als die minimale Energie erforderlich, um eine chemische Reaktion (dh verschlechtern einem gegebenen Substrat in kleinere Produkte) zu katalysieren. Für unsere Zwecke dient Aktivierungsenergie als Proxy für die Temperaturempfindlichkeit der Enzym-katalysierten Reaktionen. Höhere Aktivierungsenergie zeigt Enzym Temperaturempfindlichkeit. Ebenso sind Aktivierungsenergien (dh Fig. 5d-f) direkt an Q 10-Werte (dh den 6a-c) entsprechen. Eine weitere Erklärung von Formeln verwendet werden, um die Aktivierungsenergie berechnen und praktische Anwendung in vielen Vergangenheit gefunden werden, arbeitet 40,43-45. Arrhenius-Plots, Aktivierungsenergie und Q 10 Grundstücke bieten redundante Information und sollte nicht(Fig. 5 und 6) alle in der gleichen Handschrift verwendet werden, um Daten zur Veröffentlichung vorliegen. Deshalb, wenn die Verwendung dieser Techniken ist es notwendig, den am besten geeigneten Diagrammtyp für Ihre Enzym Temperatur wählen – Kinetik-Daten 10. Alle Diagrammtypen (Arrhenius-und Q-10) wurden hier zu Demonstrationszwecken vorgestellt, um visuelle Beispiele, wie Enzym Ergebnisse präsentieren. In unseren Beispielen haben wir geprüft Potential Enzymkinetik für mögliche C-, N-und P-EEA zwischen beiden Behandlungsstücke an den beiden Bodentiefen (Fig. 5, Fig. 6). Die Feststellung gezeigt, dass die Temperaturempfindlichkeit des EEA war nicht signifikant verschieden zwischen den Behandlungsstücke an beiden Bodentiefen für Aktivierungsenergie als in der Arrhenius-Diagramm (Fig. 5a-c) und der entsprechenden Aktivierungsenergien (Abbildung df) und (nicht überraschend) für Q gezeigt 10 plots (in diesem Beispiel zwischen 15 ° C und 25 ° C Labor Inkubationen, Fig. 6a-c). Dies legt nahe, dass die Enzymkinetik wurden nicht von den Feld experimentelle Behandlungen in dieser speziellen Studie beeinflusst. Tabelle 1. Tiefbrunnenplattenentwurf für die Fluoreszenz-Standardkonzentrationen mit Bodenproben. Vorlage für die Organisation und Be-Fluoreszenzstandards (MUB oder MUC) mit Bodenproben in das tiefe Loch-Platte vor der Inkubation. Hinweis: Die Spalten stellen die gleichen Bodenproben (800 ul von Bodenschlamm Ergänzungen). Ein Gradient von Fluoreszenzstandardkonzentrationen für jede Zeile (200 ul Ergänzungen) geladen. Jede Zelle stellt Fluoreszenz Standardkonzentration und Bodenschlamm Ergänzungen. Zum Beispiel, S1 – S12 stellen Bodenproben (800 ul von Bodenschlamm); MUB 0-100 uM = 4-Methylumbelliferone Konzentrationen (200 ul Ergänzungen). In diesem Beispiel ist die Zeile H geöffnet ist, und ist somit verfügbar, um eine höhere Fluoreszenzstandardkonzentration enthalten, falls erforderlich. Diese Entscheidung, die Standardkurve Konzentrationen erhöhen können für höhere Potenzial Enzymaktivität (und / oder die Substratkonzentrationen verwendet werden) für Ihre spezifischen Bodenproben notwendig sein. Das Potenzial Enzymaktivität für Ihre Proben sollte im Bereich der Standardkurve Werte fallen. Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen . Tabelle 2. Tiefbrunnenplatte Design für Bodenproben mit Substrat. Vorlage für die Organisation und das Laden von Bodenproben und Substrate in die tiefe Well-Platte vor der Inkubation. Anmerkung: Die Spalten stellen die gleichen Bodenproben (800 &mgr; l, soil Gülle Ergänzungen). Verschiedene Substrate werden über jede Reihe geladen (200 ul Ergänzungen). Jede Zelle stellt Bodenproben sowie Substratzugabe. Zum Beispiel, S1 – S12 sind einzigartige Bodenproben (800 ul von Bodenschlamm). Substrate (200 &mgr; l Zugaben) umfassen: BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranosid; CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobiosid; NAG = 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid; PHOS = 4-Methylumbelliferyl Phosphat: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranosid, AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranosid und LAP = L-Leucin-7-Amido-4-Methylhydrochlorid. In diesem Beispiel ist die Reihe H offen, und ist somit ein weiteres Substrat zur Verfügung, um weitere potentielle Enzymaktivität zu beurteilen, wenn gewünscht sind. Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen . Temperatur Zeit 4 ° C ~ 23 h 15 ° C 6 Stunden 25 ° C 3 Stunden 35 ° C 1,5 h Tabelle 3. Incubator Temperaturen für die entsprechenden Zeiträume erforderlich Inkubationszeit Inkubationszeit Temperaturen und entsprechende Fristen für die Enzym-Assay-Verfahren.. Tabelle 4. MUB und MUC Standardkurve Berechnungen. Zeigt, wie organisieren a) MUB und b) MUC rohen Fluoreszenzdaten (mmol), um anschließend Steigung, y-Achsenabschnitt und R-Quadrat-Werte zu berechnen. Um Steigung, y-Achsenabschnitt und R-Quadrat-Werte aus Ihrem Standard-Konzentrationskurven berechnen, wählen Sie (oder Grundstück) dieMUB und / oder MUC rohen Fluoreszenzdaten als abhängige Variable (y-Achse) und Standard-Konzentration (&mgr; mol) als unabhängige Variable (x-Achse). Hinweis:. MUB = 4-Methylumbelliferon; MUC = 7-Amino-4-Methyl Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen . Tabelle 5. . Enzymaktivität Berechnungen Zeigt, wie a) organisieren Probe rohen Fluoreszenzdaten durchzuführen und anschließend die erforderlichen Schritte (bf) EAD in berechnen: Aktivität mmol / g trockenen Boden / hr. Hinweis: S1 – S12 sind einzigartige Bodenproben. Substrate umfassen: BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranosid; CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobiosid; NAG = 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid; PHOS = 4-Methylumbelliferyl phosphate: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranosid, AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranosid und LAP = L-Leucin-7-Amido-4-Methylhydrochlorid. Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen . Fig. 1 ist. MUB Standardkurve Handlung. Scatterplot Visualisierung von Standardkurven mit rohen Fluoreszenzdaten als abhängige Variable (y-Achse) und Standardkonzentration (mmol) als unabhängige Variable (x-Achse). 2. C, N und P Radfahren Enzymaktivitäten. Potenzielle EEA an der Prairie Heizung und erhöhte CO 2-EnAnreicherung (PHACE) Standort in Kontrollparzellen (ACN: Umgebungsklimabedingungen ausgesetzt ist) und Behandlungsgrundstücke (EHN: erhöhter Temperatur und erhöhtem CO ausgesetzt 2). Boden Enzyme wurden bei a) 0-5 cm Bodentiefe und b) 5-15 cm Bodentiefe untersucht. Vertikale Balken repräsentieren Mittelwert ± SE Hinweis: ACN = Umgebungs – Klima Parzellen; EHN = erhöhter CO 2 und Heizung Parzellen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . 3. Gesamt C, N und P Radfahren Enzym stöchiometrischen Verhältnisse Die Summe der potenziellen EEA in den Erwerb von a) C, b) N beteiligt ist, und c) P-für beide Behandlungsgruppen in der PHACE Experiment in 0-5 cm und 5. – 15 cm Bodentiefe. Vertikale Balken repräsentieren Mittelwert ± SE Hinweis: ACN = Umgebungs – Klima Parzellen; EHN = erhöhter CO 2 und Heizung Parzellen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . 4. Enzym-Stöchiometrie für Gesamt-C, N, P und Radfahren Enzymaktivitäten Enzyme Nahmen stöchiometrischen Verhältnisse an der Prairie Heizung und erhöhte CO 2-Anreicherung (PHACE) Standort in Kontrollparzellen. (ACN: Klima ausgesetzt Umgebungsbedingungen) und Behandlungsgrundstücke (EHN: CO 2) zu einer erhöhten Temperatur ausgesetzt und erhöht. Gesamtboden a) C: N, b) C: P und c) N: P wurde für beide Behandlungsgruppen bei 0-5 cm und 5-15 cm Bodentiefe aufgetragen. Vertikale Balken stellen den Mittelwert ± SE Hinweis: ACN= Umgebungs – Klima Parzellen; EHN = erhöhter CO 2 und Heizung Parzellen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . 5. . Insgesamt C, N und P Radfahren Enzymaktivierungsenergien Temperaturempfindlichkeit der potentiellen EEA angezeigt mit Arrhenius-Plots für insgesamt a) C, b) N, und c) P-abbauende Enzyme, sowie die entsprechenden Aktivierungsenergie Werte für Gesamt d) C , e) N, und f) P-abbauende Enzyme zwischen den Behandlungsgrundstücke und Bodentiefe an der Prairie Heizung und erhöhte CO 2-Anreicherung (PHACE) Website. Vertikale Balken für die Aktivierungsenergie (dh df) repräsentieren Mittelwert ± SE Hinweis: ACN = ambient – Klima Parzellen; EHN = erhöhter CO 2 und Heizung Parzellen. Für die Veröffentlichung, ist es wichtig zu beachten, dass der Autor würde in der Regel wählen, entweder Arrhenius-Plots (dh ac) oder Aktivierungsenergiewerte (dh df), aber nicht beide Diagrammtypen präsentieren. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . 6. Gesamt-C-, N-und P-Rad-Enzym Q10 (15-25 ° C). Temperaturempfindlichkeiten Potential EEA gemessen als Q 10, bezogen auf Labor Inkubationen bei 15 ° C und 25 ° C für insgesamt eine) C, b) N, und c) P-abbauende Enzyme zwischen den Behandlungsgrundstücke und Bodentiefe an der Prairie Heizung und erhöhte CO 2 </ Sub> Enrichment (PHACE) Website. Vertikale Balken für Q10 repräsentieren Mittelwert ± SE Hinweis: ACN = Umgebungs – Klima Parzellen; EHN = erhöhter CO 2 und Heizung Parzellen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

Das Labor-basierte Messung von potenziellen Boden EAD wichtige Einblicke in mikrobielle Reaktionen auf ihre abiotischen Umwelt, und ihre Konsequenzen für das Funktionieren von Ökosystemen zu liefern. Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, dass Datensatz minimale Unterschiede in der Bodenenzymaktivität oder Kinetik unter Klima Behandlung Parzellen. , Inverse Tendenzen unter Parzellen fördern jedoch weitere Untersuchung der Kovariaten, die die Produktion von mikrobiellen EEA wie Bodenfeuchte, Boden-pH oder das Pflanzenwachstum beeinflussen können. Insgesamt beurteilen EEA im Hinblick auf (1) Gesamt EWR in Böden, (2) EWR-Stöchiometrie (3) Arrheniuskurven / Aktivierungsenergie, und (4) Q 10 bietet ein breites Spektrum von Ansätzen, die indikativ für Ökosystem-Level-Prozesse sein können, von denen robust charakterisieren Ökosystem Boden funktionelle Dynamik.

Hochdurchsatz-Fluoreszenz-basierten Assays EWR sind ein nützliches Werkzeug, das häufig verwendet wird, um potenzielle EEA in Böden zu untersuchen undanderen Umgebungen. Wichtig ist, Potential-Aktivitäten spiegeln die Enzym-Pool-Größe, aber nicht von selbst quantifizieren Enzymproduktion oder Fluktuationsraten 46. Obwohl die Technik ist relativ einfach, kann scheinbar geringfügige Unterschiede zwischen Labor-Protokolle die Vergleichbarkeit der Ergebnisse 13 behindern. Leider derzeit nicht wir geeignete standardisierte Positivkontrollen für EEA. Die Verwendung von stöchiometrischen Verhältnissen ist ein Ansatz zur Bewältigung dieser Herausforderungen. Ansonsten hat das Aufkommen von Hochdurchsatz-Techniken die Untersuchung von Enzymen in der Umgebung 4 vorgeschoben. Sorgfältige Interpretation der von diesen Assays erzeugten Daten können wichtige Trends in der mikrobiellen Aktivität aufzuklären.

Die Robustheit des Protokolls beruht auf der Fähigkeit, spezifisch für einzelne Proben Bedingungen auswählen, kann aber auch in Grenzen ergeben. Eine Reihe von Modifikationen erforderlich, um sicherzustellen Proben genau zu messen einzelnen Feld Seiten:

Puffer

Die Puffer Sie auswählen, wird auf dem pH-Wert des Bodens ab. Puffern stabilisiert auch die Fluoreszenzintensität der Fluoreszenzstandards, die stark pH-abhängig ist 27,47. Der pH-Puffer, die wir verwenden in der Regel um den Boden zu Brei machen, ist ein 50 mM Natriumacetat oder Tris-Puffer, die für bestimmte Säurekonstante des Puffers (pKa), um am besten entsprechen Boden gewählt wird – Probe pH-Werte. Natriumacetat einen pKa-Wert von 4,76 und Tris einen pKa-Wert von 8,06, so dass die Mengen dieser beiden Puffer werden, um die gewünschten pKa-Wert für die einzelnen Proben erreichen variieren. Phosphat-Puffer (pKa = 7,2) wurde für neutral / leicht basischen Böden vorgeschlagen. Raten wir jedoch für analytische Variabilität in Vorstudien zu testen, bevor Sie diese Puffer, wie hohe Phosphatkonzentrationen können mit der Enzymaktivität beeinträchtigen.

Handhabung und Lagerung von fluoreszierenden Substrate

jove_content "> Fluoreszenz-Assays können vor Störungen durch Verunreinigungen und / oder Instabilität vieler fluoreszierenden Verbindungen, wenn sie Licht ausgesetzt erleiden, so ist Vorsicht geboten beim Umgang mit fluoreszierenden Substraten. Wir empfehlen dringend, die Minimierung der Exposition gegenüber kein Licht fluoreszenzmarkierten Substraten und MUB und MUC-Standards . Verwendung Braunglasflaschen oder Abdecken der Glaswaren und Behältnisse für die Herstellung und Speicherung fluoreszierende Substrate und Standards verwendet wird dringend empfohlen, Aluminiumfolie, um Gläser und Behälter wickeln funktioniert gut Ebenso effizient Impfen Platten und Übertragung bis dunkel Inkubatoren ist Best Practice Wir empfehlen.. Speichern von Substraten und Standards (-20 ° C) nicht länger als zwei Monate (bei gleichzeitigem Schutz vor Licht) und Auftauen Substrate (5 ° C) ~ 24-48 Stunden vor dem Beginn der Enzym-Assay (s).

Design-und Replikations

Um beste Konto für Brunnen zu Brunnen Probe Variationen, Umsetzung negative Testkontrollen und (wenn möglich) Assay repliziert wird empfohlen. Variation tritt typischerweise aufgrund der Unterschiede in der Höhe der Bodenpartikel in jede Vertiefung und Pipettieren Fehler. Daher werden starke Durchmischung und gute Pipettiertechnik Wesentlichen gut zu minimieren, um auch Abwechslung. Darüber hinaus empfehlen wir dringend, die Implementierung eines negativen Testkontrolle (Puffer +-Substrat-Lösung), um das Substrat Unstimmigkeiten über die Zeit zu überwachen. Dies kann leicht überwacht werden, wenn das Lesen der Enzym-Platten durch den Vergleich Negativkontrollen (wir verwenden in der Regel die letzte Spalte der 96-Well-Platten). Negative Kontrollen Substrat sind typischerweise stabil, daher steigt die Signal deutlich über der Nachweisgrenze, ist es indikativ für Kontamination oder Substrat Instabilität der Ersatz des Substrats und / oder Standardlösungen erfordern.

Um den Durchsatz zu maximieren, umfasst unser Protokoll mehrere potenzielle EEA in einem tiefen Well-Mikroplatte, obwohl auch andere Protokolle führen Sie eine Art vonAssays pro Platte (dh ein Substrat pro Platte), da unterschiedliche EEA treten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Unabhängig davon, müssen Enzymoptimierung auf Böden, bevor diese über hoch-Ansatz oder der Ansatz einzigen Platte durchgeführt werden. Mehrere Substrate auf einer einzigen Platte verwendet werden, wenn die Reaktionsgeschwindigkeiten für jedes Enzym innerhalb der Zeitdauer der Inkubation relativ konsistent.

Unser Protokoll empfiehlt ~ 2,75 g Boden, um den Schlamm-Lösung zu machen, während ~ 1 Gramm ist in anderen Protokollen 24 empfohlen. Wir schlagen vor, dass die Verwendung von mehr Boden (wenn möglich) ist ein effektiver Ansatz für eine bessere Erfassung in-Boden-Proben Variation der Enzymaktivität Ebenen. In diesem Protokoll inkubieren wir 800 ul Aufschlämmung Boden mit 200 ul Substrat, während andere nur inkubiert 200 ul Bodenschlamm mit 50 ul von Substraten. Das ist einfach eine Funktion durch die Aufstockung der, dass letztlich nicht die gemessene Aktivität ändern. Es gibt auch praktische Vorteilefür die Verwendung von größeren Mengen. Eins, ist es einfacher, Bodenpartikel zu vermeiden, während Pipettieren in entsprechende schwarze Flachboden-96-Well-Platten vor der Aufnahme auf dem Fluorometer Intensitäten. Zweitens ist das zusätzliche Volumen nützlich im Falle von versehentlich verschütteten Flüssigkeiten, während die schwarzen Flachboden-96-Well-Platten der Übertragung auf dem Fluorometer vor der Aufnahme Enzym bezogenen Fluoreszenzintensitäten. Schon geringe Abweichungen in Volumen Fluoreszenz deutlich sinken unter Brunnen. Schließlich ist aufgrund des hohen Durchsatzes der Natur dieses Protokolls wählt man üblicherweise auf experimentellen Replikation angewiesen, um Variation der Enzymaktivitätsniveaus anstatt die Durchführung des Tests repliziert darstellen. Es ist immer am besten, Praxis, analytische Wiederholungen enthalten, aber in der Praxis, fühlen wir uns unserem Protokoll bietet eine ausgewogene Abwägung zwischen analytischen und experimentellen Replikate angesichts der begrenzten Ressourcen. Ebenso nutzt unser Ansatz relativ gut homogenisiert Boden (2,75 g) pro Test 25, die istntly in-Boden-Varianten ab. Die Entscheidung, analytische Wiederholungen verwenden sollte sorgfältig durch Testen auf analytische Fehler in Vorstudien 48 berücksichtigt werden. Wir empfehlen jedoch, dass experimentelle Designs mit weniger als 4 Behandlungsgruppen-Wiederholungen sollten in Erwägung ziehen Assay repliziert.

Boden, Puffervolumina und Substratkonzentration Optimierung

Die Bodenpuffer: Substratkonzentration Verhältnis ist eine wichtige Variable, die einen starken Einfluss auf die gemessene Fluoreszenz bei der Durchführung von Enzymtests. Die Höhe des Bodens in der Aufschlämmung gegeben, um zu untersuchen oder die Konzentration des Substrats muss je nach der Aktivität der Enzyme, die in der Bodenprobe eingestellt werden. Die für dieses Beispiel gewählt Beträge wurden bei früheren Tests dieser Böden basiert, um sicherzustellen, dass die Substratverfügbarkeit wurde nicht einschränkende, und dass wir maximal möglichen Messraten unter den Testbedingungen (V max) 44,45. Für Bodenproben, die hohe Konzentrationen von Enzymen haben, muss die Menge an Boden oder Substratkonzentration erhöht werden. Wir haben gefunden, dass eine Erhöhung Substratkonzentrationen (und Einstellen der Standardkurve entsprechend) kann die Linearität der Kurve beeinflussen. Wir empfehlen daher, Verringerung der Bodenwerte und / oder proportional Anpassungen Puffervolumen wie nötig. Unabhängig davon ist es wichtig, dass die Substratkonzentration für jeden Bodentyp untersucht, weil optimieren gemessen EAD durch eine Größenordnung größer zwischen gesättigten und Unter gesättigte Substratkonzentrationen 26 unterscheiden. Daher Unterschiede zwischen experimentellen Behandlungen (usw.) sind anfällig für Typ II statistische Fehler und weniger wahrscheinlich an Untersättigungsbedingungen nachgewiesen werden, und statistische Fehler 27,35. Um Substratkonzentrationen zu optimieren, sollten vorläufige Enzym-Assays auf repräsentativen Bodenproben unter Verwendung einer Vielzahl von Substratkonzentrationen. NachAufzeichnen der Fluoreszenz, einfach die Daten zeichnen (ähnlich wie bei der Standardkurve Beispiel, Fig. 1), um die Substrat-Konzentration (x-Achse), die zur Enzymaktivität (y-Achse) entspricht, zu identifizieren, wo die Steigung einpendelt (~ 0). Ebenso kann die Substratkonzentration entsprechend dem Punkt, wo die Neigung einpendelt (~ 0) ist ein guter Indikator für die optimale Substratkonzentration für diesen bestimmten Böden.

Dieser Assay misst Fluoreszenz letztendlich in einer bestimmten durch die Einheit, die vom fluorogenen Substrat als Folge der Enzym-vermittelter Depolymerisation Substrat gespalten wird erzeugt. Daher ist Schritt 5 (Substratzugabe) kritisch und muß, um die Zeit zwischen dem, wenn das Substrat den Boden gegeben und wenn die Assays inkubiert werden minimiert so effizient wie möglich durchgeführt werden. Ebenso, wenn das Substrat in Kontakt mit der Probe, werden enzymatische Reaktionen aufzutreten beginnen. Wir empfehlen die Verwendung eines Multi-Channel-Pipette aus diesem Grund. Es wird dringend empfohlen, sich effizient mit Hilfe der Multi-Kanal-Pipette vor dem Tag Sie die Durchführung Ihrer Enzym-Assays. Um dies zu erreichen, können Sie Pipettieren mit Wasser üben, bis Sie leicht Mengen übertragen in die 96-Well-Platten mit der Pipette.

Boden Abschrecken

Quenchen bezeichnet Abnahme der Fluoreszenzintensität von Partikeln und / oder organisches Material in den Boden Schlämme-Inkubationen 26 verursacht. Pufferverhältnisse 25: Abschrecken kann durch Einstellen der Boden beeinflusst werden. Aufgrund der Hintergrundfluoreszenz von einzelnen Proben, ist es entscheidend, um Standards mit Proben für den Hintergrund (Abschrecken) Fluoreszenz-Konto laufen. Obwohl einige Protokolle verwenden einen einzigen Zusammenschluss, nach der Prüfung, dass das Signal linear ist, empfehlen wir die Durchführung einer Standard-Löschsteuerung für jede Probe, um beste Kontrolle für die Auswirkungen der Abschreckung. Andernfalls wird in einem Stand führenStandardkurve nicht auf die Probe und eine falsche Einschätzung der enzymatischen Aktivität. Die Zugabe von Standards zu Boden Aufschlämmungen ist nicht zeitempfindlich, da die Standardadditions beeinflusst nicht die Hintergrundfluoreszenz von der Probe.

NaOH-Zugabe

Die Zugabe von NaOH wird in einigen Protokollen zur fluorimetrischen Messungen der Enzymaktivität zu optimieren, da der Fluoreszenzfarbstoff aus den synthetischen Substraten freigesetzt zeigt Peak-Fluoreszenz bei pH> 9,0 26,49. Wenn man diesen Vorschlag wird die NaOH-Konzentration erforderlich, um den Boden Aufschlämmungs-pH (dh pH> 9) in Abhängigkeit von der bestimmten Boden variieren, und der pH-Puffer 26 verwendet. Jedoch argumentieren andere, dass NaOH nicht notwendig sein, da die Signalintensität ist im Allgemeinen sehr hoch, auch bei niedrigeren pH-Wert, und weil es eine zusätzliche Quelle für Messfehler führt. Zum Beispiel wurde die Wirkung von NaOH auf pH der Aufschlämmung Zusätze und damit MUB oder MUC fluorescence 25 Veränderungen über die Zeit. MUB verknüpft Substraten haben gezeigt, dass konsequente erhöhte Fluoreszenz für 20 min NaOH folgende Ergänzungen vor Ebenen verjüngen demonstrieren, während MUC hat stetige zeigten verringerte Fluoreszenz für bis zu 60 min 26. Daher ist es wichtig, die Zeit zwischen Zugabe von NaOH und Fluoreszenzmessung zu standardisieren. Alternativ, wenn Fluoreszenzwerte sind ausreichend nachweisbar ohne Zugabe, die Durchführung der Tests ohne Zugabe von NaOH wurde als gleichermaßen akzeptable Alternative 26 vorgeschlagen worden.

Temperatur

Temperaturempfindlichkeit sollte bei der Entscheidung Inkubationstemperatur genommen werden. Wenn das primäre Interesse ist das Verständnis Enzymkinetik, mit drei oder mehr Temperaturen, wie dargestellt, mit Arrhenius-Plots (im Ergebnisteil) ist ein robustes Konzept. Wenn die Probe Seite hat charakteristisch niedrigen Temperatur, wie Permafrostboden, dann die duration der Inkubation kann müssen erweitert werden, um für die Enzyme, um in den kälteren Temperaturen Inkubation reagieren können. Während traditionelle Enzymkinetik legt nahe, dass eine Erhöhung der Temperatur sollte zu einer erhöhten Enzymaktivität zur Folge haben wir festgestellt, daß Enzyme können ortsspezifische in Bezug auf die Temperaturempfindlichkeit 50 sein. Daher ortsspezifischen Enzymaktivität Potential verstehen, ist es wichtig, dass der Inkubationstemperatur und-dauer eingestellt werden, um Feldwerte Ort zu reflektieren.

Abschluss

AgE sind wichtige Treiber der biogeochemischen Prozesse in Böden und damit müssen wir in der Lage, ihre Aktivitäten zu messen. Es gibt viele Herausforderungen zu Mess EEA in Böden, einschließlich Störungen und Hemmung. Trotz dieser Herausforderungen können standardisierte Protokolle (wie das hier beschrieben) universell einsetzbar EAD für eine breite Palette von Enzymen zu messen. Zwar ist es ziemlich einfach, Qualitätsdaten zu generieren folgende dieser Protokolle, die inInterpretation dieser Daten in einem ökologischen Kontext erfordert eine sorgfältige Prüfung, was diese Tests sind wirklich messen, und wie EEA unter Testbedingungen können sich von denen unter in-situ Bedingungen abweichen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Veröffentlichung wurde von der Enzyme in der Umweltforschungskoordination Netzwerk Forschung von der US National Science Foundation (DEB # 1021559) unterstützt finanziert. Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (DEB # 1021559) und das US Department of Office of Science Energy (Biologische und Umweltforschung) unterstützt. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen und die in dieser Dokumentation sind die der Autoren und nicht unbedingt die Ansichten der US-NSF reflektieren.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalogue number Comments
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) Sigma Aldrich M9766 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) Sigma Aldrich M3633 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) Sigma Aldrich M6018 Cellulose degradation
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) Sigma Aldrich L2145 Protein degradation
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) Sigma Aldrich M2133 Chitin degradation
4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) Sigma Aldrich M8883 Phosphorus mineralization
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) Sigma Aldrich M7008 Hemicellulose degradation
4-Methylumbelliferone (MUB) Sigma Aldrich M1381
7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) Sigma Aldrich A9891
50 mM Sodium acetate anhydrous buffer Fisher Scientific S210-500 acidic and neutral soils
50 mM Tris base buffer Fisher Scientific BP154-1 basic soils
Equipment
Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs Fisher Scientific 14-512-65 pipetting reservoir
Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel Fisher Scientific 13-684-265 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl
TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips USA Scientific 1112 – 1720 10 racks of 96 tips (960 tips)
Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. Fisher Scientific 11-100-100SH Lab disc magnetic stir plate
Waring blender Fisher Scientific 14-509-7P Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container
BRAND Dispensette III bottle-top dispensers Fisher Scientific 13-688-231 Dispenser; range: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltic pumps Fisher Scientific 13-683-7 Optional dispenser
Fisherbrand magnetic stir bar Fisher Scientific 1451363SIX Used to stirr soil slurry afer blending
Pyrex glass bowls World Kitchen 5304218 Pyrex 10 oz rimmed custard cup
Costar 96-well black solid plates Fisher Scientific 07-200-590 Used for plate reader step
Costar 96-well assay blocks Fisher Scientific 07-200-700 V-bottom; 2 ml; sterile
Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats Fisher Scientific 14-387-93 Sterile 96-well cap mat for square wells
Centrifuge equipped with holders for deep-well plates Thermo Scientific 3121 Centra-GP8 (this model is no longer available)
Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader Tecan 30016058 Plate reader (this model is no longer available)
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Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca, J. D., Steinweg, J. M., McMahon, S. K., Wallenstein, M. D. High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities. J. Vis. Exp. (81), e50961, doi:10.3791/50961 (2013).
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