الإنتاجية العالية فلوروميتريك قياس التربة المحتملة خارج الخلية أنزيم الأنشطة
Summary
لقياس معدلات المحتملة لأنشطة انزيم خارج الخلية التربة، وتضاف ركائز الاصطناعية التي لا بد أن صبغة الفلورسنت لعينات التربة. يتم قياس نشاط الإنزيم كما يتم تحرير صبغة الفلورسنت من الركيزة عن طريق رد فعل الانزيم المحفز، حيث يشير ارتفاع مضان تدهور أكثر الركيزة.
Abstract
الميكروبات في التربة وغيرها من البيئات انتاج الانزيمات خارج الخلية ليزيل البلمرة ويتحلل الجزيئات العضوية بحيث يمكن استيعابهم للحصول على الطاقة والمواد المغذية. قياس التربة نشاط انزيم الميكروبية أمر حاسم في فهم ديناميات النظام الإيكولوجي التربة وظيفية. المفهوم العام للمقايسة انزيم مضان هو أن الاصطناعية C-، N-، أو ف الغنية ملزمة مع ركائز صبغة الفلورسنت تضاف لعينات التربة. عندما سليمة، ركائز المسمى لا يتألق. يتم قياس نشاط انزيم كما الزيادة في مضان كما هي المشقوق الأصباغ الفلورية من ركائز بهم، مما يسمح لهم ليتألق. ويمكن التعبير عن القياسات انزيم في وحدات من المولية أو النشاط. لإجراء هذا الاختبار، يتم إعداد عجائن التربة من خلال الجمع بين التربة مع الحموضة عازلة. المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني (عادة خلات الصوديوم 50 ملي أو 50 ملي تريس العازلة)، والذي تم اختياره لحمض خاصة التفكك المستمر المخزن المؤقت (الباكاف الحمضية) لمطابقة أفضل سا التربةmple درجة الحموضة. يتم تلقيح للعجائن التربة مع كمية من nonlimiting fluorescently المسمى (أي C، N-، أو ف الغنية) الركيزة. باستخدام عجائن التربة في مقايسة يعمل على تقليل القيود المفروضة على انزيم والركيزة نشرها. وبالتالي، فإن هذا الفحص الضوابط الاختلافات في الحد الركيزة، ومعدلات الانتشار، وظروف التربة ودرجة الحموضة، وبالتالي الكشف عن معدلات نشاط انزيم المحتملة بوصفها وظيفة من الفرق في تركيز انزيم (في العينة).
المقايسات انزيم مضان عادة ما تكون أكثر حساسية من الطيفي (أي اللونية) المقايسات، ولكن يمكن أن تعاني من التداخل الذي تسببه الشوائب وعدم الاستقرار في العديد من المركبات الفلورسنت عند تعرضها للضوء، لذا الحذر مطلوب عند التعامل مع ركائز الفلورسنت. وبالمثل، وهذه الطريقة فقط بتقييم أنشطة انزيم المحتملة في الظروف المختبرية عندما ركائز لا يحد. ينبغي توخي الحذر عند تفسير البيانات التي تمثل الصليبيمكن مقارنات الموقع مع اختلاف درجات الحرارة أو أنواع التربة، كما هو الحال في الوضع الطبيعي نوع التربة ودرجة الحرارة تؤثر على حركية الانزيم.
Introduction
وتشارك الإنزيمات خارج الخلية (إي إي إس) التي تنتجها بكتيريا التربة والفطريات، والعتيقة في العمليات البيولوجية الكيميائية التي لا حصر لها، وتعتبر أساسية لتجهيز والاستقرار، وزعزعة الاستقرار من المواد العضوية في التربة وتدوير المغذيات في النظم الإيكولوجية الأرضية 1. من خلال إنتاج EES والميكروبات في التربة تتحلل وتحويل المواد العضوية إلى جزيئات البوليمر للذوبان أصغر، وبالتالي تحرير ملزمة سابقا الدقيقة والمغذيات، والذي يسمح النباتات والميكروبات لاستيعاب المواد المغذية متوفرة من التربة. وقد تم دراسة EES على مدى عقود، في المقام الأول عن طريق قياس أنشطتها في فحوصات المختبر 2-4، لأنه من الصعب جدا للكشف عن مباشرة وقياس الانزيمات.
يتم التحكم نشاط انزيم خارج الخلية (EEA) بشدة من تركيز الأنزيمات وركائز المقابلة. وفرة مختلفة C-، ويتم التحكم N، P-مهينة والانزيمات في التربة بفعل عوامل عديدة طالكتلة الحيوية الميكروبية التسبب، وتكوين المجتمع، وتوافر الركيزة، والصغير، ومطالب متكافئة 5،6، ومع ذلك، في EEAS الموقع الطبيعي داخل بيئة التربة التي تتأثر أيضا بدرجة الحرارة 7،8، وملزمة من الانزيمات لالطين التربة وخصائص الدبالية 2، والقيود نشر 9، التي تنظم في نهاية المطاف تجمع انزيم نشط، من حيث الحجم، وتوافر الركيزة ، ومعدلات دوران 10-12. لذا، معترفا في ظروف التربة الموقعية أمر بالغ الأهمية عند استخدام المقايسات انزيم مختبر لتفسير وظيفة الميكروبية التربة عبر مواقع بيئية مختلفة.
العديد من فئات مختلفة من المنطقة الاقتصادية الأوروبية يمكن قياسها كميا في فحوصات المختبر باستخدام مجموعة متنوعة من ركائز الاصطناعية (يرجى الرجوع إلى "قائمة الكواشف الجدول" لمزيد من التفاصيل). بعض البروتوكولات الاستفادة من ركائز في المقايسات التي تقترن الى رد فعل اللونية التي يمكن الكشف مع طيفي، ث: رغم آخرين، بما في ذلك البروتوكول وصفنا هنا، والاستفادة من ركائز التي لا بد أن شاردة الفلورسنت. المقايسات مضان EE وعادة ما تكون أكثر حساسية (عن طريق أمر من حجم) من المقايسات اللونية (التي تستخدم شاردة مولد اللون مرتبط مع الركيزة الاصطناعية) 12-14. يتضمن حساسية في الكشف EEA جانبين: أحدهما يرتبط كمية مجمع الفائدة وغيرها من الكشف عن ذات الصلة إلى أدنى كشف نشاط انزيم المحتملة. طرق اللونية ف نيتروفينول المقايسات (PNP) المستندة يمكن العثور عليها في الماضي يعمل 15،16. باختصار، التربة (منخول عادة إلى <2 مم والمجفف في الهواء) وحضنت في الأمثل أو حقل ذات الصلة درجة الحرارة ودرجة الحموضة. المعدل الذي يتم تحديد ناتج التفاعل صدر colorimetrically مع طيفي 14. هي حساسية أعلى من المقايسات انزيم مضان ويرجع ذلك جزئيا إلى الكشف عن أكثر حساسية للفصل شاردة الفلورة المرتبطة SUBSTRأكلت تدهور بدلا من تسجيل الامتصاصية بعد فصل شاردة مولد اللون محددة في طول موجة محددة. الأكثر شيوعا مؤشرات الفلورسنت الاصطناعية هما 4 methylumbelliferone (MUB) 17 و 7 الأمينية-4-methylcoumarin (MUC) 18،19. ترتبط ركائز MUC المرتبطة عادة مع ركائز الاصطناعية N-الغنية مثل البروتينات و / أو الأحماض الأمينية. تم تطوير تقنيات الفلورسنت الأول للعينات المائية 20،21، وتطبيقها على التربة يتطلب ضوابط لتبريد إشارة والتدخل 22،23. يمكن أن تكون إما فحوصات أجريت باستخدام التقليدية "أعلى مقاعد البدلاء" الكيمياء مع كميات كبيرة، أو يمكن استخدامها في البروتوكولات القائمة على صفيحة ميكروسكوبية، مع زيادة الإنتاجية ولكن ربما خطأ في القياس العالي. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات واستشهد على نطاق واسع للكشف الفلورسنت من EEAS في التربة 24، والعديد من مختبرات توظيف اختلافات دقيقة على هذه البروتوكولات، وغالبا دون قصد أو بسبب الاختلافق في المعدات المختبرية أو الكواشف. الاختلافات الصغيرة التي تبدو في تفاصيل البروتوكولات يمكن أن تؤثر بقوة قياس EEAS 25،26 وعدم وجود الانزيمات موحدة يجعل من التحدي لمعايرة المقايسات بين المختبرات المختلفة. وبالتالي، هناك حاجة مهمة لنشر بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتشجيع توحيد المقايسات المنطقة الاقتصادية الأوروبية.
في بروتوكول لدينا، يتم إعداد عينات من التربة من خلال الجمع بين عينات التربة مع الحموضة عازلة والمجانسة مع الخلاط. ثم يتم تلقيح للعجائن مع كمية من nonlimiting fluorescently المسمى C، N-، أو ف الغنية الركيزة، الذي تم اختياره اعتمادا على سؤال البحث محددة من الفائدة. باستخدام عجائن التربة في المقايسات انزيم بمثابة التحكم للحد من القيود الركيزة نشرها. وتطفأ الأنصاف الفلورسنت حتى يتم المشقوق أنها من ركائز كل منها، ويمكن أن يتم الكشف عن النشاط وبالتالي الانزيم كما يتم تحرير صبغة الفلورسنت من الركيزة بذ رد فعل الانزيم المحفز. تزايد كثافة مضان عبر الزمن يعكس معدل التفاعل المحفز الانزيم.
المفهوم العام للمقايسة انزيم مضان هو أن ركائز الاصطناعية ملزمة مع شاردة الفلورة (صبغة الفلورسنت)، تضاف إلى عينات من التربة 27. خلال حفز انزيم تدهور الركيزة، والسندات فواصل بين صبغة الفلورسنت والركيزة. وبالتالي استخدام صبغة الفلورسنت تتحرر من الركيزة إلى تقييم غير المباشرة للنشاط انزيم، ويمكن أن يكون كميا باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية للكشف عن كثافة مضان من الصبغة. في سطور، ويتم إنجاز مضان الكمي كما الصبغة المحررة تنبعث ضوء طول موجي واحد بعد امتصاص الضوء من طول موجة مختلفة. وسجلت كثافة مضان من قبل قارئ لوحة قادرة على حد سواء الإثارة والكشف. يمكن قياس نشاط انزيم في وقت لاحق على أساس المعروف بغية دراسته واقراره الفلورسنت صبغntrations الركيزة (أي كميات معروفة من الركيزة الاصطناعية المضافة إلى عينات من التربة) جنبا إلى جنب مع الرجوع إلى منحنى تخفيف مستوى كثافة مضان لشاردة الفلورة محددة من الركيزة المستخدمة في فحص (أي 4 methylumbelliferone (MUB) أو 7-الأمينية -4-methylcoumarin (MUC)). (يرجى الرجوع إلى القسم بروتوكول للحصول على تفاصيل محددة عن نشاط انزيم الكمي).
المقايسات انزيم المختبرية للتربة هي مفيدة لتقييم وظيفة المجتمع الميكروبية، ولكن هناك العديد من القيود التقنية التي يجب على المستخدمين التعرف على 10. يمكن المقايسات مضان تعاني من التداخل الذي تسببه الشوائب و / أو عدم استقرار العديد من المركبات الفلورسنت عند تعرضها للضوء، لذلك الحذر مطلوب عند التعامل مع ركائز الفلورسنت 25. الجسيمات التربة و / أو المواد العضوية في التربة عجائن يمكن أيضا تتداخل مع كثافة مضان، والمعروفة باسم تأثير التبريد 26.علاوة على ذلك، المقايسات انزيم المختبر يقيم فقط EEAS المحتملة في الظروف المختبرية. في المختبر فحوصات قياس EEAS تحت الظروف التي نشرها الركيزة وفرة وnonlimiting. وبالتالي، فإن البيانات التي تقدمها هذه المقايسات قد لا تكون وكيل جيد للEEAS تحت ظروف التربة في الوضع الطبيعي 10. عموما، نشاط انزيم مفيد جدا لالمقارنات النسبية في أي نوع من أنواع التربة متشابهة. ومع ذلك، عند استخدام هذا الأسلوب للمقارنة بين الأنشطة التربة التي تختلف في الخصائص الفيزيائية أو الكيميائية، وينبغي أن تستخدم بحذر. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الاختلافات في نوع التربة ودرجة الحرارة يمكن أن يغير بشكل جذري دولة في حركية إنزيم الوضع الطبيعي هذا. الحد الآخر هو أن عدد قليل نسبيا من ركائز المتاحة تجاريا (بالمقارنة مع البيئة الطبيعية). علاوة على ذلك، ركائز الاصطناعية المستخدمة لفحوصات انزيم هي بسيطة نسبيا (القابلة للذوبان بسهولة) قد لا تمثل بدقة ركائز التربة الحالية أو المتوفرهه في الموقع. عامل آخر للنظر هو أن استخدام عجائن التربة سيتضمن نشاط بعض الإنزيمات استقرت (أي يجمد بواسطة المواد العضوية أو الطين) التي قد لا تكون نشطة في ظل ظروف في الموضع 2. المقايسات انزيم المختبر أيضا لا تقدم معلومات بشأن استمرار الإنزيمات في التربة (معدلات دوران انزيم) أو معلومات بشأن الأنواع الميكروبية المحددة التي تنتج الإنزيمات التربة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القياس المختبري من EEAS التربة المحتملة يمكن أن توفر معلومات هامة عن ردود الميكروبية لبيئتها غير الحيوية، وآثارها على أداء الأنظمة الإيكولوجية. نتائج هذه مجموعة بيانات سبيل المثال تشير إلى أن الحد الأدنى من الاختلافات موجودة في نشاط انزيم التربة أو حركية بين المؤامرات العلاج المناخ. ومع ذلك، واتجاهات عكسية بين المؤامرات تشجيع مزيد من التحقيقات من المتغيرات التي قد تؤثر على إنتاج EEAS الميكروبية مثل رطوبة التربة، ودرجة الحموضة في التربة أو نمو النبات. عموما، تقييم EEAS من حيث (1) EEA عموما في التربة، (2) EEA العناصر المتفاعلة (3) الطاقة المؤامرات أرينيوس / التنشيط، و (4) س 10 يوفر مجموعة واسعة من الأساليب التي يمكن أن تكون مؤشرا على عمليات مستوى الأنظمة الإيكولوجية من الذي تميز بقوة النظام البيئي التربة ديناميات وظيفية.
عالية الإنتاجية المستندة إلى مضان فحوصات EEA هي أداة مفيدة التي يتم استخدامها على نطاق واسع لدراسة EEAS المحتملة في التربة والبيئات الأخرى. الأهم من ذلك، تعكس الأنشطة المحتملة في حجم تجمع الانزيم، ولكن لا من قبل أنفسهم قياس معدلات الإنتاج أو دوران الانزيم 46. على الرغم من أن التقنية هي بسيطة نسبيا، يمكن أن الاختلافات التي تبدو طفيفة بين بروتوكولات المختبر تعيق مقارنة النتائج 13. للأسف، ليس لدينا حاليا مناسبة الضوابط الإيجابية موحدة لEEAS. استخدام نسب القياس المتكافئ هو نهج واحد للتغلب على هذه التحديات. خلاف ذلك، فإن ظهور تقنيات عالية الإنتاجية وقد تقدمت دراسة الإنزيمات في البيئة 4. تفسير دقيق للبيانات التي تولدها هذه المقايسات قد توضيح الاتجاهات الهامة في النشاط الميكروبي.
متانة بروتوكول ينبع من القدرة على اختيار لشروط محددة لعينات فردية، ولكن هذا يمكن أن يؤدي أيضا إلى القيود. وسوف تكون هناك حاجة لسلسلة من التعديلات لضمان تقاس بدقة عينات لل المواقع الميدانية الفردية:
العازلة
سوف المخزن المؤقت قمت بتحديد تعتمد على درجة الحموضة في التربة. التخزين المؤقت كما تستقر كثافة مضان من المعايير الفلورسنت، والتي هي غاية تعتمد درجة الحموضة 27،47. المخزن المؤقت الحموضة التي نستخدمها عادة لجعل التربة الطين هو 50 ملي خلات الصوديوم أو عازلة تريس الذي يتم اختياره للالمخزن المؤقت خاصة حمض التفكك المستمر (الباكاف الحمضية) لأفضل مباراة التربة – مستويات الحموضة العينة. خلات الصوديوم لديه من 4.76 الباكاف الحمضية، وتريس لديه من 8.06 الباكاف الحمضية وبالتالي فإن كميات من هذه المخازن المؤقتة اثنين تختلف في أجل الوصول إلى الباكاف الحمضية المطلوب للعينة الفردية. العازلة الفوسفات (الباكاف الحمضية = 7.2) وقد اقترح للتربة محايدة / الأساسية قليلا. ومع ذلك، فإننا نحذر لاختبار التباين التحليلي في الدراسات الأولية قبل استخدام هذا المخزن المؤقت، وتركيزات الفوسفات عالية قد تتداخل مع نشاط انزيم.
المناولة والتخزين من ركائز الفلورسنت
jove_content "> يمكن المقايسات الإسفار تعاني من التداخل الذي تسببه الشوائب و / أو عدم استقرار العديد من المركبات الفلورسنت عند تعرضها للضوء، لذلك الحذر مطلوب عند التعامل مع ركائز الفلورسنت، ونحن نوصي بشدة التقليل من أي التعرض للضوء لfluorescently المسمى ركائز وMUB والمعايير MUC وباستخدام الزجاجات العنبر أو تغطية الأواني الزجاجية والعبوات المستخدمة لصنع وتخزين ركائز ومعايير الفلورسنت ينصح بشدة؛ رقائق الألومنيوم التفاف الأواني الزجاجية والحاويات يعمل بشكل جيد وبالمثل، بتلقيح بكفاءة لوحات ونقل إلى حاضنات الظلام هو أفضل الممارسات نوصي. تخزين ركائز ومعايير (-20 درجة مئوية) لمدة لا تزيد عن شهرين (في حين حمايتها من الضوء)، وركائز ذوبان (5 ° C) ~ 24-48 ساعة قبل بداية فحص انزيم (ق).تصميم والنسخ المتماثل
لأفضل حساب للجيدا للتغيرات العينة جيدا، وتنفيذ نيجاتيفضوابط فحص البريد وينصح (إن أمكن) يعيد الفحص. الاختلاف يحدث عادة بسبب الاختلافات في كمية جزيئات التربة في كل بئر والأخطاء pipetting ل. وبالتالي، فإن خلط قوية وتقنية جيدة pipetting للحد كبير كذلك لاختلاف أيضا. وعلاوة على ذلك، فإننا نقترح بقوة تنفيذ السيطرة الفحص سلبية (عازلة + حل الركيزة) لرصد التناقضات الركيزة مع مرور الوقت. هذا ويمكن رصدها بسهولة عند قراءة لوحات انزيم بمقارنة آبار المراقبة السلبية (ونحن عادة استخدام العمود الأخير على لوحات 96 أيضا). ضوابط الركيزة السلبية عادة ما تكون مستقرة، وبالتالي فإن الزيادات إشارة أعلى بكثير من حد الكشف، فإنه يدل على تلوث أو عدم الاستقرار الركيزة، مما يتطلب استبدال الركيزة و / أو الحلول القياسية.
لتحقيق أقصى قدر من الإنتاجية، ويشمل بروتوكول لدينا العديد من EEAS المحتملة في واحدة صفيحة ميكروسكوبية بئر عميقة، على الرغم من البروتوكولات الأخرى أداء نوع واحد منفحص في لوحة (أي ركيزة واحدة لكل لوحة) منذ EEAS مختلفة تحدث بمعدلات مختلفة. بغض النظر، يجب إجراء انزيم الأمثل على التربة قبل تنفيذ هذا النهج عالية في جميع أنحاء أو نهج لوحة واحدة. ركائز متعددة يمكن استخدامها على لوحة واحدة إذا كانت معدلات التفاعل تتسق نسبيا لكل انزيم في غضون الفترة الزمنية من الحضانة.
توصي بروتوكول لدينا ~ 2.75 ز التربة لجعل الحل الطين، في حين ينصح ~ 1 غرام في البروتوكولات الأخرى 24. نقترح أن استخدام المزيد من التربة (إن أمكن) هو نهج فعال لالتقاط أفضل داخل عينة التربة الاختلاف في مستويات نشاط انزيم. في هذا البروتوكول، ونحن احتضان 800 ميكرولتر من الطين التربة مع 200 ميكرولتر الركيزة، في حين أن آخرين احتضان فقط 200 ميكرولتر من الطين التربة مع 50 ميكرولتر من ركائز. هذا هو مجرد وظيفة من رفع مستوى هذا لا يغير في نهاية المطاف النشاط المقاسة. وهناك أيضا مزايا عمليةلاستخدام كميات أكبر. واحد، فمن الأسهل لتجنب الجسيمات التربة في حين pipetting لوحات سوداء في 96 جيدا مسطحة القاع قبل ان يسجل شدة على التألق المقابلة. الثانية، وحجم إضافية مفيدة في حالة تسرب عرضي أثناء نقل السوداء لوحات 96 جيدا مسطحة القاع إلى التألق قبل ان يسجل كثافة مضان المتعلقة الانزيم. وحتى الانحرافات الطفيفة في حجم انخفاض ملحوظ مضان بين الآبار. أخيرا، نظرا لطبيعة إنتاجية عالية من هذا البروتوكول، وننتخب عادة إلى الاعتماد على النسخ المتماثل التجريبية لتمثيل التباين في مستويات نشاط انزيم بدلا من أداء يعيد الفحص. هو دائما أفضل الممارسات لتشمل مكررات التحليلية، ولكن في الممارسة العملية، ونحن نشعر يوفر بروتوكول لدينا المقايضة متوازنة بين مكررات التحليلية والتجريبية نظرا لمحدودية الموارد. وبالمثل، نهجنا يستخدم التربة نسبيا المتجانس أكثر جيدا (2.75 غ) في فحص 25، والذي لازميقلل ntly داخل التربة الاختلافات. قرار استخدام مكررات التحليلية ينبغي النظر بعناية من قبل لاختبار الخطأ التحليلي في الدراسات الأولية 48. ومع ذلك، فإننا نوصي بأن تصاميم تجريبية مع عدد أقل من 4 مكررات المعاملة المجموعة ينبغي أن تنظر بقوة باستخدام مقايسة مكررات.
التربة، وحدات التخزين الاحتياطي، وتحسين تركيز الركيزة
المخزن المؤقت التربة: نسبة تركيز الركيزة هو متغير الهامة التي تؤثر تأثيرا قويا في مضان قياس عند تنفيذ المقايسات الانزيم. وأضاف كمية من التربة في الطين لفحص أو قد تحتاج تركيز الركيزة لتعديلها اعتمادا على نشاط الإنزيمات في عينة التربة. استندت المبالغ التي اختيرت لهذا المثال على التجارب السابقة من هذه التربة لضمان توافر الركيزة كان nonlimiting، والتي كنا قياس أقصى معدلات المحتملة في ظل ظروف الاختبار (V كحد أقصى) 44،45. ومع ذلك، للحصول على عينات التربة التي تحتوي على تركيزات عالية من الأنزيمات، يجب زيادة كمية التربة أو تركيز الركيزة. لقد وجدنا أن زيادة تركيزات الركيزة (وتعديل منحنى القياسية وفقا لذلك) يمكن أن تؤثر الخطي من المنحنى. لذا، فإننا نوصي خفض كميات التربة و / أو تعديلات تتناسب مع أحجام العازلة حسب الضرورة. بغض النظر، فإنه من المهم لتحسين تركيز الركيزة لكل نوع التربة يعاير لأن EEAS قياس يمكن أن تختلف بأمر من حجم أكبر بين تركيزات الركيزة المشبعة والمشبعة الفرعية 26. وبالتالي الخلافات بين العلاجات التجريبية (الخ) هي عرضة للخطأ من النوع الثاني الإحصائية وأقل احتمالا ليتم الكشف في ظروف تشبع الفرعية، والخطأ الإحصائي 27،35. لتحسين تركيزات الركيزة، ينبغي إجراء فحوصات أولية الانزيم على عينات التربة ممثل باستخدام مجموعة واسعة من تركيزات الركيزة. بعدتسجيل مضان، ببساطة رسم البيانات (على غرار المثال منحنى القياسية؛ الشكل 1) لتحديد تركيز الركيزة (محور س) الذي يتوافق مع نشاط انزيم (المحور الصادي) حيث مستويات المنحدر قبالة (~ 0). وبالمثل، فإن تركيز الركيزة المقابلة لنقطة حيث مستويات المنحدر قبالة (~ 0) يعتبر مؤشرا جيدا للتركيز الركيزة الأمثل لتلك التربة معينة.
هذا الاختبار يقيس نهاية المطاف مضان على وقت معين تنتجها شاردة الفلورة التي المشقوق من الركيزة نتيجة بوساطة انزيم الركيزة التحلل. وبالتالي، الخطوة 5 (بالإضافة الركيزة) أمر بالغ الأهمية ويجب إجراء بأكبر قدر من الكفاءة من أجل تقليل الوقت بين عندما يتم إضافة الركيزة إلى التربة وعندما يتم تحضين المقايسات. وبالمثل، وبمجرد أن الركيزة يأتي في اتصال مع العينة، وسوف تبدأ التفاعلات الإنزيمية تحدث. نوصي باستخدام متعدد القنواتماصة لهذا السبب. ويقترح بشدة أن تصبح فعالة باستخدام ماصة متعدد القنوات قبل اليوم كنت تنفذ المقايسات انزيم الخاص بك. لتحقيق هذا، يمكنك ممارسة pipetting لمع الماء حتى يمكنك بسهولة نقل مجلدات في لوحات 96 جيدا مع pipettor الخاص بك.
التربة تسقيه
تبريد يشير إلى تناقص كثافة مضان الناجمة عن الجسيمات و / أو المواد العضوية في التربة عجائن-حضانات 26. التبريد يمكن أن تتأثر ضبط التربة: نسب العازلة 25. بسبب مضان الخلفية من العينات الفردية، فمن الأهمية بمكان لتشغيل المعايير مع عينات لحساب الخلفية (تبريد) مضان. على الرغم من بعض بروتوكولات استخدام تركيز واحد بعد ثبوت أن الإشارة الخطية، ونحن نوصي بشدة تنفيذ السيطرة إخماد القياسية لكل عينة لسيطرة أفضل للآثار التبريد. وعدم القيام بذلك يؤدي إلى موقفمنحنى ارض لا ينطبق على العينة، وتقدير غير صحيح من النشاط الأنزيمي. إضافة إلى معايير عجائن التربة ليست حساسة للوقت، وإضافة معيار لا يؤثر على مضان الخلفية من العينة.
هيدروكسيد الصوديوم بالإضافة
يستخدم إضافة هيدروكسيد الصوديوم في بعض البروتوكولات لتحسين قياسات نشاط انزيم فلوروميتريك لأن صبغة الفلورسنت التي صدرت من ركائز الاصطناعية يسلك مضان الذروة في الرقم الهيدروجيني> 9.0 26،49. عند النظر في هذا الاقتراح، فإن تركيز هيدروكسيد الصوديوم اللازمة لدرجة الحموضة الطين التربة (أي أن الرقم الهيدروجيني> 9) تختلف تبعا للتربة خاصة ودرجة الحموضة عازلة تستخدم 26. ومع ذلك، يرى آخرون أن هيدروكسيد الصوديوم قد لا يكون ضروريا بسبب كثافة إشارة عموما عالية جدا حتى في انخفاض الرقم الهيدروجيني، ولأنه يقدم مصدرا إضافيا للخطأ في القياس. على سبيل المثال، تأثير الإضافات هيدروكسيد الصوديوم على درجة الحموضة الطين وبالتالي fluore MUB أو MUCالتغييرات مسرح الحادث مع مرور الوقت 25. وقد ثبت ركائز MUB ربط لإثبات زيادة مضان متسقة لمدة 20 دقيقة بعد الإضافات هيدروكسيد الصوديوم قبل تفتق المستويات، في حين أثبتت MUC ثابت انخفض مضان لمدة تصل إلى 60 دقيقة 26. وبالتالي، فإنه من المهم توحيد الوقت بين هيدروكسيد الصوديوم بالإضافة إلى ذلك وقياس مضان. بدلا من ذلك، إذا كانت مستويات مضان يمكن اكتشافها بما فيه الكفاية من دون علاوة على ذلك، إجراء فحوصات دون إضافة هيدروكسيد الصوديوم وقد اقترح كبديل مقبول على حد سواء 26.
درجة الحرارة
ينبغي أن تؤخذ حساسية درجة الحرارة في الاعتبار عند اتخاذ قرار درجة حرارة الحضانة. إذا كان الاهتمام الأساسي هو فهم حركية الانزيم، وذلك باستخدام ثلاثة أو أكثر من درجات الحرارة كما هو موضح باستخدام المؤامرات أرينيوس (في المقطع النتائج) هو نهج قوية. إذا كان موقع العينة لديه درجة حرارة منخفضة بشكل مميز مثل التربة دائمة التجمد، ثم duratioن من الحضانة قد تحتاج إلى أن تمتد للسماح الانزيمات لتتفاعل في درجات حرارة أكثر برودة الحضانة. في حين تشير حركية إنزيم التقليدية أن أي زيادة في درجة الحرارة ينبغي أن يؤدي إلى زيادة نشاط انزيم، وجدنا أن الإنزيمات قد يكون موقع معين من حيث درجة الحرارة 50 حساسية. وبالتالي لفهم إمكانات نشاط انزيم في مواقع محددة فمن الأهمية بمكان أن درجة حرارة الحضانة ومدتها تعديلها لتعكس القيم موقع الميدان.
استنتاج
إي إي إس هي السائقين الحرجة من العمليات البيولوجية الكيميائية في التربة، وبالتالي فإننا بحاجة إلى أن تكون قادرة على قياس أنشطتها. هناك العديد من التحديات التي تواجه قياس EEAS في التربة، بما في ذلك التداخل وتثبيط. على الرغم من هذه التحديات، بروتوكولات موحدة (كما هو موضح هنا) يمكن تطبيقها عالميا لقياس EEAS لمجموعة واسعة من الانزيمات. في حين أنه من السهل نسبيا لتوليد البيانات التالية نوعية هذه البروتوكولات، وفيterpretation من هذه البيانات في سياق البيئي يتطلب دراسة متأنية لهذه المقايسات ما يتم قياس حقا، وكيف قد تختلف EEAS في ظل ظروف الفحص من هم دون سن في ظروف الموقع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المنشور من قبل الإنزيمات في البيئة بحوث تنسيق البحوث الشبكة بدعم من مؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية (DEB # 1021559). وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (DEB # 1021559)، وزارة الخارجية الأميركية مكتب الطاقة للعلوم (البيولوجية والبحوث البيئية). أي الآراء والنتائج والاستنتاجات والتوصيات الواردة في هذه المادة هي آراء أصحابها ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر جبهة الخلاص الوطني في الولايات المتحدة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Reagents: | |||
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) | Sigma Aldrich | M9766 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) | Sigma Aldrich | M3633 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) | Sigma Aldrich | M6018 | Cellulose degradation |
| L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) | Sigma Aldrich | L2145 | Protein degradation |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) | Sigma Aldrich | M2133 | Chitin degradation |
| 4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) | Sigma Aldrich | M8883 | Phosphorus mineralization |
| 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) | Sigma Aldrich | M7008 | Hemicellulose degradation |
| 4-Methylumbelliferone (MUB) | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) | Sigma Aldrich | A9891 | |
| 50 mM Sodium acetate anhydrous buffer | Fisher Scientific | S210-500 | acidic and neutral soils |
| 50 mM Tris base buffer | Fisher Scientific | BP154-1 | basic soils |
| Equipment | |||
| Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs | Fisher Scientific | 14-512-65 | pipetting reservoir |
| Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel | Fisher Scientific | 13-684-265 | 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl |
| TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips | USA Scientific | 1112 – 1720 | 10 racks of 96 tips (960 tips) |
| Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. | Fisher Scientific | 11-100-100SH | Lab disc magnetic stir plate |
| Waring blender | Fisher Scientific | 14-509-7P | Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container |
| BRAND Dispensette III bottle-top dispensers | Fisher Scientific | 13-688-231 | Dispenser; range: 5-50 ml |
| Wheaton Unispense μP peristaltic pumps | Fisher Scientific | 13-683-7 | Optional dispenser |
| Fisherbrand magnetic stir bar | Fisher Scientific | 1451363SIX | Used to stirr soil slurry afer blending |
| Pyrex glass bowls | World Kitchen | 5304218 | Pyrex 10 oz rimmed custard cup |
| Costar 96-well black solid plates | Fisher Scientific | 07-200-590 | Used for plate reader step |
| Costar 96-well assay blocks | Fisher Scientific | 07-200-700 | V-bottom; 2 ml; sterile |
| Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats | Fisher Scientific | 14-387-93 | Sterile 96-well cap mat for square wells |
| Centrifuge equipped with holders for deep-well plates | Thermo Scientific | 3121 | Centra-GP8 (this model is no longer available) |
| Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader | Tecan | 30016058 | Plate reader (this model is no longer available) |
References
- Burns, R. G., Dick, R. P. . Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, (2002).
- Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
- Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
- Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
- Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
- Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 245-258 (2011).
- Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
- Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
- Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
- Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
- Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
- Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
- Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O., Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. . Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. , (1999).
- Tabatabai, M. A., Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. . Methods of Soil Analysis. 2, 903-947 (1994).
- Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
- Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
- Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER – MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
- Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
- DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
- German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
- Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
- Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
- Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
- Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
- Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151 (2006).
- Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 229-243 (2011).
- Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
- Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
- Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
- Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
- German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis – Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
- German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
- Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
- Sterner, R. W., Elser, J. J., Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. , 179-230 (2002).
- Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
- Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279 (1982).
- Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
- Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
- Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
- Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79 (1986).
- Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
- Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
- Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).
