הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), paramyxovirus עופות המשתייכים לסוג Avulavirus ^1, הוא סוכן zoonotic כלכלי רלוונטי ובכך נחקר באופן נרחב ומעקבים, אשר באופן חמור יכול להשפיע על גידול עופות בכל רחבי העולם. למרות שלא הפתוגן אנושי, NDV גם נחקר ביסודיות מעבר לשדה הווטרינר הן כparamyxovirus מודל ובשל המאפיינים שלה מעניינים מאוד, הטבעיים oncolytic ^6. מחקר על NDV תועלת רב מהפיתוח של טכניקות גנטיקה הפוכה לוירוסים חד גדילים, שאינם מפולחים תחושה השלילית RNA, שתוארו לראשונה על ידי וירוס כלבת Conzelmann וcoleagues ^2. מגוון של NDVs מהונדס גנטי, שנשא גנים או שינויים של הגנום הסוג הבר זרים נחקרו בהרחבה מאז. עבודה עם וירוסי רקומביננטי אלה הייתה קריטית כדי לאפיין גורמים ארסי שונים, לא רק של NDV אלא גם של הומא הרלוונטי האחרn פתוגנים כמו שפעת ⁷ וירוס – וירוס Nipah או מתהווה ^8. יתר על כן, מספר מחקרים שונים בחנו את השימוש בטכניקות הללו כדי לשפר את פעילות antitumoral המולדת של NDV ^6,9,10, בעיקר על ידי שיפור מאפייני immunostimulatory של הנגיף. אזור רלוונטי אחר של מחקר על NDVs רקומביננטי היה הדור של מועמדי חיסון נגד מחלות ויראליות אחרות כמו שפעת ^{5,11,12, 13} איידס, חצבת ^{14, 15} סארס, או שנגרם על ידי נגיף sincytial הנשימה (RSV) ^16. בין היתרונות הבולטים השונים הניתנים על ידי NDV הם חוסר החסינות קיימת מראש באוכלוסיות אנושיות, היציבות מוסיף חוץ גנטי, חוסר פעילות recombinatory וכולל פרופיל בטיחות גבוה בשילוב עם מאפייני immunostimulatory הטבעיים האמורים ^17. זה גם ראוי לציון השימוש הפוטנציאלי של חיסונים דו ערכי רקומביננטי בעמ 'oultry, שפעת עופות מגנה מפני שני NDV ופתוגניים מאוד וירוסי ^11,12. זו עשויה להיות דרך מצוינת כדי להפחית את הסיכויים של האחרון מתפשטים מטבע לבעלי חיים מבויתים, ובכך גם עוזרים למנוע קפיצת היתר ספציפית אפשרית של שפעת עופות חשש לבני אדם. לבסוף, NDV-להביע כתב היה בשימוש להערכה של תגובות חיסוניים מולדים, כמו גם זיהוי של אנטגוניסט אינטרפרון המקודד על ידי וירוסים מרובים ^18-27.

תהליך ההצלה של רקומביננטי, שאינו מפולח, נגיף RNA שלילי תקוע בעצם מורכב באופן מלאכותי מאלץ את מחזור שכפול נגיפי בתא ייצור על ידי transfecting קידוד cDNA המכונות מינימליות התולעת מולקולרית, המכונים ribonucleoprotein או RNP (איור 2). RNPs מורכב של פולימראז הנגיפי (P וחלבונים L), nucleoprotein (NP) ורנ"א antigenomic באורך המלא של הנגיף. RNA + antigenome זו הוא התבנית דואר הנדרשת עבור הדור של RNA-הגנום המשלים, אשר, קשור גם עם שאר החלבונים של RNP הנגיפי, משחזרת את אותו מורכב מדבק שנגיף טבעי ישחרר בציטופלסמה של התא על זיהום (איור 2A ). משלב זה ואילך, המחזור הנגיפי יכול להמשיך באופן טבעי וויריונים רקומביננטי, encapsidating גנומים שונה, יופקו (איור 2). למרבה הפלא, transfection של cDNA גנומי במקום cDNA antigenomic מאוד פוגע או לחלוטין מבטל את יעילות הצלת ^2,28-30. גם כאשר cDNA antigenomic הוא transfected, את היעילות של encapsidation של RNA רקומביננטי לRNPs בתאי transfected היא כנראה נמוכה מאוד. בגלל זה, פרוטוקולי הצלה לNDV לעתים קרובות כוללים צעדים שונים להגברה של כמה חלקיקים נגיפיים שוחררו מתאי transfected במקור על ידי coculturing אותם עם תאים מתירנית ו / או על ידיזיהום של ביצי embryonated.

לפני ההצלה, ניתן להשפיע cDNA על ידי נהלי שיבוט סטנדרטיים על מנת ליצור את השינויים הרצויים. בעוד מוטציות ספציפיות של מוצרי גן השונים ורצפים רגולטוריים של הנגיף יכולות להיות מושגת בדרך זו בצורה ישירה, רבים של העבודה שפורסמה מעורבת NDV רקומביננטי דרש תוספת של יחידת תעתיק חדשה לתוך הגנום NDV. כמו חברים אחרים במשפחת paramyxovirus, הגנום מקודד NDV שמונה חלבונים שונים לשש יחידות תעתיק, אשר באות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בהתאם למיקום שלהם ביחס לסוף '3 ​​בשיפוע יורד קריטי עבור מחזור החיים הנגיפי ^1. בגלל זה, את המיקום של יחידת תעתיק החדשה בתוך הגנום חייב להיות שנבחר בקפידה כדי להשיג איזון בין הביטוי של transgene וירידת הערך של שכפול נגיפי. הכנסה בין P וגני M כבר בשימוש, לא הכיאתרים אחרים האף גם נבדקו ^13,31.

לא משנה מה להוסיף, השיבוט לNDV cDNA צריך לעקוב אחר כמה כללים כדי ליצור מבנה rescuable: (i) כל גן חדש שייכלל לתוך הגנום NDV צריך להיות תחת שליטה של ​​האותות המתאימים לRNA תלוי-RNA הנגיפי פולימראז. רצפים אלה יש להוסיף במעלה הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה החדשה (ORF) כך פולימראז יכול לזהות את הסוף של הגן הקודם (GE) ותחילתו של transgene החדש (GS), במרווחים של רצף intergenic נוקלאוטיד יחיד (IG) . תוספת של קוזאק תקף (K) רצף כדי לשפר את תרגום ריבוזומלי אוקריוטים מומלץ גם לחלבון זר ביטוי טוב יותר ³² (ii) שכפול יעיל של NDV, כמו עבור רוב בני משפחת Paramyxoviridae, תלוי באורך הגנום להיות מרובה של שש ^33, ולכן כל כניסה לתוך NDV יש לעקוב "השלטון של שש" הזה. במידת צורך, reqניתן להוסיף נוקלאוטידים נוספים uired מורד הזרם ORF החדש, וכן (iii) את הרצף של transgene צריך להיבדק כדי למצוא אפשרי GE ו GS כמו רצפים אשר עלול לפגוע ביעילות הצלה, ביטוי transgene ו / או כדאיות וירוס. אם קיימים, רצפים אלה יש להסיר על ידי mutagenesis השקט. הדור של cDNA באורך המלא רקומביננטי הבא כללים הנ"ל הוא הצעד הראשון כדי לייצר ביעילות NDV מהונדס גנטי כמפורט כאן.

במערכת כל בונה DNA נמצא תחת שליטה של אמרגן פולימראז T7-RNA (איור 3). פולימראז cytoplasmic זה מסופק בטרנס ידי coinfection עם vaccinia וירוס אנקרה הותאם רקומביננטי (MVA-T7) ^34. איור 3 א מציג את פלסמיד pNDV-B1, אשר מקודד cDNA antigenomic באורך מלא ^5. איור 3 ב מציג פלסמידים pTM1 קידוד NP, ORFs P ו-L. פלסמידים pCITE-GFP, אשר מקודד, under אמרגן T7, החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP), וpCAGGS GFP ^18, אשר מקודד באותו ORF תחת האמרגן אקטין בטא עוף ^35, משמשים כקבוצת ביקורת. בפרוטוקול זה אנו מציגים את ההליך כדי להציל NDV רקומביננטי מcDNA של B1 lentogenic NDV Hitchner זן ⁵ (איור 4).