Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d'ADNc

Virus de la maladie de Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviaire appartenant au genre Avulavirus ^1, est un agent zoonotique économiquement pertinent et donc largement étudiée et surveillée, qui peuvent gravement affecter l'élevage de volailles dans le monde entier. Bien que n'étant pas un agent pathogène humain, NDV a également été étudiée à fond au-delà du champ de vétérinaire à la fois comme un paramyxovirus de modèle et en raison de ses très intéressantes, les propriétés oncolytiques naturelles ^6. Recherche sur le NDV a grandement bénéficié de l'évolution des techniques de génétique inverse pour, non segmentés virus à ARN négatif simple brin de sens, d'abord décrits pour le virus de la rage par Conzelmann et coleagues ^2. Une variété de NDVs génétiquement modifiées, portant des gènes ou des modifications de leur génome de type sauvage étrangers ont été largement étudiées depuis. Travailler avec ces virus recombinants a été critique à caractériser les différents facteurs de virulence non seulement de NDV, mais aussi d'autres HUMA pertinenten agents pathogènes tels que les virus influenza A ⁷ – ou l'émergence virus Nipah ^8. En outre, un certain nombre de différentes études ont exploré l'utilisation de ces techniques pour améliorer l'activité anti-tumorale innée de NDV ^6,9,10, principalement en améliorant les propriétés immunostimulantes du virus. Autre domaine de recherche concerné sur NDVs recombinants a été la production de vaccins candidats contre d'autres maladies virales telles que la grippe ^{5,11,12, 13} VIH, la rougeole ^{14, 15} SRAS, ou celle causée par le virus respiratoire sincytial (RSV) ^16. Parmi les différents avantages remarquables fournis par NDV sont l'absence d'immunité préexistante dans les populations humaines, la stabilité des inserts étrangers génétiques, un manque d'activité et recombinatoire ensemble un profil de sécurité élevé combiné avec les propriétés immunostimulantes naturels mentionnés ci-dessus ^17. Il est également intéressant de noter l'utilisation potentielle de vaccins bivalents recombinants dans poultry, de protection à la fois contre le NDV et influenza aviaire hautement pathogène virus ^11,12. Cela peut être un excellent moyen de réduire les risques de propagation de la dernière sauvage des animaux domestiques, ce qui contribuerait à éviter un possible saut inter-spécifique de la grippe aviaire à l'homme redoutable. Enfin, le journaliste exprimant NDV ont été utilisés pour l'évaluation des réponses immunitaires innées ainsi que l'identification de l'interféron antagoniste codée par plusieurs virus ^18-27.

Le processus de délivrance d'un recombinant, non segmenté, virus ARN à brin négatif se compose essentiellement de forcer artificiellement un cycle de réplication virale dans une cellule produisant par transfection de l'ADNc codant pour la machinerie moléculaire infectieuse minimale, dite ribonucléoprotéine ou RNP (Figure 2). Les RNP consistent en la polymerase virale (P et les protéines L), la nucléoprotéine (NP) et la longueur totale de l'ARN antigénomique du virus. Cet ARN antigénomique + e estmodèle de e requise pour la génération des ARN-génomes complémentaires, qui, également associés avec le reste des protéines de la RNP virale, reprend le même complexe infectieux d'un virus naturel libérerait le cytoplasme de la cellule lors de l'infection (Figure 2A ). De cette étape en avant, le cycle viral peut procéder naturellement et virions recombinants, encapsidation des génomes modifiés, sera généré (figure 2B). Remarquablement, la transfection de l'ADNc génomique à la place de l'ADNc antigénomique nuit considérablement ou supprime sauvetage efficacité ^2,28-30 complètement. Même lorsque l'ADNc antigénomique est transfecté, l'efficacité de l'encapsidation de l'ARN recombinant dans des RNP dans les cellules transfectées est probablement très faible. Pour cette raison, les protocoles de sauvetage pour NDV comprennent souvent des différentes étapes de l'amplification de ces particules virales libérées par les cellules transfectées à l'origine par leur co-culture avec des cellules permissives et / ou par l'infection des œufs embryonnés.

Avant la délivrance, l'ADNc peut être manipulé par des techniques de clonage standard afin de générer les modifications désirées. Alors que les mutations spécifiques des différents produits des gènes et des séquences régulatrices du virus peuvent être carrément obtenus de cette façon, la plupart des travaux publiés concernant NDV recombinant a nécessité l'ajout d'une nouvelle unité de transcription dans le génome du NDV. Comme d'autres membres de la famille des paramyxovirus, le génome du NDV code pour huit protéines différentes en six unités transcriptionnelles qui sont exprimés de façon différentielle en fonction de leur localisation relativement à l'extrémité 3 'dans un gradient critique pour le cycle de vie viral ^une diminution. De ce fait, l'emplacement de la nouvelle unité de transcription dans le génome doit être soigneusement choisie pour obtenir un équilibre entre l'expression du transgène et de la déficience de la réplication virale. Insertion entre gènes P et M a été le plus utilisé, tautres sites Hough ont également été testés ^13,31.

Quelle que soit la pièce, le clonage de l'ADNc dans NDV doit suivre certaines règles pour générer une construction rescuable: (i) tout nouveau gène à être inclus dans le génome NDV doit être sous le contrôle des signaux appropriés pour l'ARN-dépendante de l'ARN viral polymerase. Ces séquences doivent être ajoutés en amont du nouveau cadre de lecture ouvert (ORF) de sorte que la polymerase peuvent reconnaître la fin du gène précédent (GE) et le début de la nouvelle transgène (GS), espacée par une seule séquence intergénique de nucleotides (IG) . L'addition d'un Kozak valide (K) Séquence d'améliorer traduction ribosomale eucaryotique est également recommandé pour une meilleure expression de la protéine étrangère ^32, (ii) la réplication efficace du NDV, comme pour la plupart des membres de la famille des Paramyxoviridae, est fonction de la longueur du génome étant multiple de six ^33, par conséquent, une insertion dans le NDV doit suivre cette «règle de six». Si nécessaire, required nucléotides supplémentaires peuvent être ajoutés en aval de l'ORF de nouveau, et (iii) la séquence du transgène doit être vérifié pour trouver possible GE et GS comme des séquences qui pourraient nuire à l'efficacité de sauvetage, l'expression du transgène et / ou la viabilité du virus. S'ils sont présents, ces séquences doivent être éliminés par mutagenèse silencieuse. La génération d'ADNc de pleine longueur recombinant suivant les règles mentionnées ci-dessus est la première étape en vue de produire efficacement un NDV génétiquement modifiés comme indiqué ici.

Dans le système toutes les constructions d'ADN sont sous le contrôle du promoteur de la polymérase T7 ARN (figure 3). Cette polymerase cytoplasmique est fournie en trans par co-infection avec un virus recombinant modifié de la vaccine Ankara (MVA-T7) ^34. Figure 3A montre le plasmide pNDV-B1, qui code pour la longueur complète de l'ADNc antigénomique ^5. Figure 3B montre les plasmides PTM1 codant NP, P et L ORF. Les plasmides pCITE-GFP, qui code pour, under du promoteur T7, la protéine fluorescente verte (GFP), et pCAGGS GFP ^18, qui code pour le même ORF sous le promoteur de l'actine bêta poulet ^35, sont utilisés comme contrôles. Dans ce protocole, on montre la procédure pour sauver NDV recombinant à partir de l'ADNc de la souche de NDV lentogène Hitchner B1 ⁵ (Figure 4).