Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un paramixovirus aviar perteneciente al género Avulavirus ^1, es un agente zoonótica económicamente relevante y por lo tanto ampliamente investigado y vigilado, que pueden afectar gravemente a la cría de aves en todo el mundo. Aunque no es un patógeno humano, NDV también se ha estudiado a fondo más allá del campo veterinario tanto como un modelo de paramixovirus y debido a sus propiedades altamente interesantes oncolíticos naturales, ^6. Investigación sobre el NDV se benefició en gran medida del desarrollo de técnicas de genética inversa para los virus de una sola cadena, no segmentados de sentido negativo de ARN, descrito por primera vez por el virus de la rabia por Conzelmann y coleagues ^2. Una variedad de NDVs modificados genéticamente con genes extraños o modificaciones de su tipo salvaje genoma se ha estudiado ampliamente desde entonces. Trabajar con estos virus recombinantes ha sido fundamental para caracterizar los diferentes factores de virulencia no sólo de NDV, sino también de otros huma relevanten patógenos, tales como virus de influenza A ⁷ – o la emergente Nipah virus ^8. Además, un número de diferentes estudios han explorado el uso de estas técnicas para mejorar la actividad antitumoral innata de NDV ^6,9,10, sobre todo mediante la mejora de las propiedades inmunoestimulantes del virus. Otro ámbito de investigación en NDVs recombinantes ha sido la generación de candidatos a vacunas contra otras enfermedades virales como la gripe ^{5,11,12, 13} VIH, sarampión ^{14, 15} SARS o la causada por el virus respiratorio sincytial (VRS) ^16. Entre las diversas ventajas notables prestados por NDV son la falta de inmunidad preexistente en la población humana, la estabilidad de los insertos extranjeros genéticos, la falta de actividad recombinatorios y en general un alto perfil de seguridad combinado con las propiedades inmunoestimulantes naturales antes mencionados ^17. También es digno de mención el uso potencial de las vacunas bivalentes recombinantes en poultry, la influenza aviar de protección tanto contra el NDV y altamente patógeno virus de ^11,12. Esto puede ser una excelente manera de reducir las posibilidades de que este último se diseminan desde silvestre a los animales domésticos, por lo que también ayuda a prevenir un posible salto inter-específica de la temida gripe aviar a los humanos. Por último, el reportero-expresando NDV se han utilizado para la evaluación de la respuesta inmune innata, así como la identificación de antagonista de interferón codificada por múltiples virus ^18-27.

El proceso de rescate de un recombinante, no segmentado, virus de ARN de cadena negativa consiste básicamente en forzar artificialmente un ciclo de replicación viral en una célula que produce mediante la transfección de ADNc que codifican la maquinaria molecular infecciosa mínima, conocida como ribonucleoproteína o RNP (Figura 2). Los RNPs consisten de la polimerasa viral (P y proteínas L), la nucleoproteína (NP) y de la longitud completa de ARN antigenómico del virus. Este ARN + antigenoma es the plantilla requerida para la generación de los genomas de ARN-complementarios, los cuales, también asociados con el resto de las proteínas de la RNP viral, recapitula el mismo complejo infecciosa que un virus natural sería liberar en el citoplasma de la célula después de la infección (Figura 2A ). A partir de este paso adelante, el ciclo viral puede proceder de forma natural y viriones recombinantes, encapsidadoras los genomas modificados, será generado (Figura 2B). Sorprendentemente, la transfección del ADNc genómico en lugar del cDNA antigenómico perjudica en gran medida o completamente suprime la eficiencia de rescate ^2,28-30. Incluso cuando se transfectó ADNc antigenómico, la eficiencia de la encapsidación del ARN recombinante en RNPs en células transfectadas es probablemente muy baja. Debido a esto, los protocolos de rescate para NDV a menudo incluyen diferentes pasos para la amplificación de las pocas partículas virales liberadas por las células transfectadas originalmente por cocultivo con células permisivas y / o por elinfección de huevos embrionados.

Antes de rescate, el ADNc se puede manipular por procedimientos de clonación estándar con el fin de generar las modificaciones deseadas. Mientras que las mutaciones específicas de los diferentes productos de los genes y las secuencias reguladoras del virus se pueden lograr sin rodeos esta manera, muchos de los trabajos publicados que involucran NDV recombinante ha requerido la adición de una nueva unidad de transcripción en el genoma de NDV. Al igual que otros miembros de la familia de los paramixovirus, el genoma de NDV codifica ocho proteínas diferentes en seis unidades de transcripción, que se expresan diferencialmente dependiendo de su ubicación respecto al extremo 3 'en un gradiente decreciente crítico para el ciclo de vida viral ^1. Debido a esto, la ubicación de la nueva unidad de transcripción dentro del genoma debe ser cuidadosamente seleccionado para lograr un equilibrio entre la expresión del transgén y el deterioro de la replicación viral. De inserción entre los genes P y M se ha utilizado la mayor parte, tHough otros sitios también se han probado ^13,31.

Cualquiera que sea la pieza de inserción, la clonación en ADNc de NDV tiene que seguir algunas reglas para generar un constructo rescatable: (i) cualquier nuevo gen que se incluirán en el genoma de NDV tiene que estar bajo control de las señales apropiadas para la viral dependiente de ARN-ARN polimerasa. Estas secuencias deben ser añadidos aguas arriba del nuevo marco de lectura abierto (ORF) de modo que la polimerasa puede reconocer el final del gen anterior (GE) y el comienzo de la nueva transgén (GS), separados por una sola secuencia de nucleótidos intergénica (IG) . También se recomienda la adición de un Kozak válida (K) de secuencia para mejorar la traducción eucariótica ribosómico para una mejor expresión de la proteína extranjera ^32; (ii) la replicación eficiente de NDV, como para la mayoría de los miembros de la familia Paramyxoviridae, es dependiente de la longitud del genoma de ser múltiplo de seis ^{de 33,} por lo tanto, cualquier inserción en el NDV tiene que seguir esta "regla de los seis". Si es necesario, se reqnucleótidos adicionales pedirá otra se pueden añadir aguas abajo de la ORF de nuevo, y (iii) la secuencia de transgén deben ser evaluados para encontrar posibles GE y GS como secuencias que puedan perjudicar la eficiencia del rescate, la expresión del transgen y / o la viabilidad del virus. Si está presente, estas secuencias deben ser removidos mediante mutagénesis silenciosa. La generación de ADNc de longitud completa recombinante siguiendo las reglas anteriormente mencionadas es la primera etapa con el fin de producir eficientemente un NDV genéticamente modificado como se detalla aquí.

En el sistema de todas las construcciones de ADN se encuentran bajo el control del promotor de T7 ARN polimerasa (Figura 3). Esta polimerasa citoplásmica se proporciona en trans por la coinfección con un vaccinia modificado Ankara del virus recombinante (MVA-T7) ^34. Figura 3A muestra el plásmido pNDV-B1, que codifica el ADNc de longitud completa antigenómico ^5. Figura 3B muestra los plásmidos pTM1 que codifica NP, ORFs P y L. Los plásmidos pCITE-GFP, que codifica, uajo el promotor T7, la proteína verde fluorescente (GFP), y pCAGGS GFP ^18, que codifica la misma ORF bajo el promotor de beta-actina de pollo ^35, se utilizan como controles. En este protocolo se muestra el procedimiento para rescatar NDV recombinante a partir del ADNc de la cepa lentogénica de NDV Hitchner B1 ⁵ (Figura 4).