الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، والفيروسة المخاطانية الطيور تنتمي إلى جنس Avulavirus ^1، هو وكيل الحيوانية ذات الصلة من الناحية الاقتصادية، وبالتالي بحثها على نطاق واسع وsurveilled، والتي يمكن أن تؤثر بشدة على تربية الدواجن في جميع أنحاء العالم. وإن لم يكن العامل الممرض الإنسان، NDV كما تم دراسة وافية وراء المجال البيطري على حد سواء باعتبارها نموذجا الفيروسة المخاطانية ونظرا لاهتمام للغاية، والخصائص الطبيعية حال الورم ^6. البحث عن NDV استفادت كثيرا من تطوير تقنيات الوراثة العكسية لاحد الذين تقطعت بهم السبل، غير مجزأة فيروسات RNA-بالمعنى السلبي، وصف لأول مرة لفيروس داء الكلب من قبل Conzelmann وcoleagues ^2. مجموعة متنوعة من NDVs المعدلة وراثيا، التي تحمل الجينات أو تعديلات على النوع البري الجينوم الأجنبية وقد درس على نطاق واسع منذ ذلك الحين. العمل مع هذه الفيروسات المؤتلف كانت حاسمة لتوصيف عوامل الفوعة مختلفة ليس فقط من NDV ولكن أيضا من هوما الأخرى ذات الصلةن مسببات الأمراض مثل فيروس الانفلونزا ⁷ – أو الناشئة نيباه فيروس ^8. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الدراسات المختلفة قد استكشفت استخدام هذه التقنيات لتحسين النشاط antitumoral الفطرية NDV ^6،9،10، معظمها من خلال تعزيز خصائص مناعة من الفيروس. وكانت منطقة أخرى ذات الصلة من البحوث حول NDVs المؤتلف الجيل المرشحين لقاح ضد الأمراض الفيروسية الأخرى مثل الأنفلونزا ^{5،11،12، 13} فيروس نقص المناعة البشرية، والحصبة ^{14، 15} السارس، أو أن يسببها فيروس sincytial التنفسي (RSV) ^16. بين مختلف المزايا التي تقدمها يذكر NDV هي نقص المناعة الموجودة مسبقا في التجمعات البشرية، واستقرار إدراج الأجنبية الوراثية، وقلة النشاط recombinatory وعموما لمحة سلامة عالية جنبا إلى جنب مع خصائص مناعة الطبيعية المذكورة آنفا ^17. ومن الجدير بالذكر أيضا إمكانية استخدام لقاحات الثنائي التكافؤ المؤتلف في عoultry والفيروسات واقية ضد كل من NDV وأنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض ^11،12. وهذا قد يكون وسيلة ممتازة لتقليل فرص انتشار هذا الأخير من البرية للحيوانات المستأنسة، مما يساعد أيضا على منع ممكن قفزة أمور محددة من إنفلونزا الطيور إلى البشر اللعين. أخيرا، استخدمت NDV، معربا عن مراسل لتقييم الاستجابات المناعية الفطرية وكذلك تحديد مضاد للفيروسات مضاد الفيروسات المشفرة بواسطة عدة ^18-27.

عملية الانقاذ من المؤتلف، غير مجزأة، فيروس الحمض النووي الريبي السلبية تقطعت بهم السبل يتكون أساسا على إجبار مصطنع دورة تكاثر الفيروس في الخلايا المنتجة عليها بنقل كدنا] ترميز الحد الأدنى من الآلات الجزيئية المعدية، والمعروفة باسم بروتين نووي ريبوزي أو الأداء الملاحي المطلوب (الشكل 2). تتكون RNPs من بوليميريز الفيروسية (P و L البروتينات)، والبروتين النووي (NP) وكامل طول الحمض النووي الريبي antigenomic الفيروس. هذا الحمض النووي الريبي + antigenome هو القالب البريد اللازمة لجيل من الحمض النووي الريبي التكميلية-الجينوم، والتي، ويرتبط أيضا مع بقية البروتينات الفيروسية من الأداء الملاحي المطلوب، يلخص نفس المجمع المعدية أن الفيروس الطبيعية ستفرج عن سيتوبلازم الخلية على العدوى (الشكل 2A ). من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن للدورة الفيروسية المضي قدما بشكل طبيعي وvirions المؤتلف، encapsidating الجينوم تعديل، سيتم إنشاء (الشكل 2B). بشكل ملحوظ، ترنسفكأيشن من [كدنا] الجيني بدلا من [كدنا] antigenomic يضعف إلى حد كبير أو كليا تلغي الكفاءة الانقاذ ^2،28-30. حتى عندما يتم transfected كدنا] antigenomic، كفاءة encapsidation من الحمض النووي الريبي المؤتلف في RNPs في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل هو على الارجح منخفضة للغاية. وبسبب هذا، بروتوكولات الانقاذ لNDV غالبا ما تشمل الخطوات المختلفة لالتضخيم من عدد قليل من الجسيمات الفيروسية التي صدرت من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل أصلا من قبل coculturing لهم خلايا متساهلة و / أو من قبلإصابة البيض المحتوي.

قبل الإنقاذ، [كدنا] يمكن التلاعب بها من إجراءات الاستنساخ القياسية من أجل توليد التعديلات المرغوبة. بينما الطفرات محددة من المنتجات المختلفة وتسلسل الجينات التنظيمية للفيروس يمكن أن يتحقق بشكل مباشر بهذه الطريقة، فإن العديد من الأعمال المنشورة التي تنطوي المؤتلف NDV وقد تطلب إضافة وحدة جديدة النسخي في جينوم فيروس النيوكاسل. مثل أعضاء آخرين من عائلة الفيروسة المخاطانية، الجينوم NDV بترميز ثمانية بروتينات مختلفة في ست وحدات النسخي، والتي يتم التعبير عنها بشكل مختلف اعتمادا على الاحترام مواقعها إلى 3 'نهاية التدرج في خفض الحرجة لدورة حياة الفيروسية ^1. بسبب هذا، وموقع وحدة النسخي جديدة داخل الجينوم يجب اختيارها بعناية لتحقيق التوازن بين التعبير عن التحوير وضعف من تكاثر الفيروس. وقد استخدمت الإدراج بين P والجينات M أكثر، ركما تم اختبار مواقع أخرى هوغ ^13،31.

مهما كانت إدراج، استنساخ [كدنا] في NDV يحتاج إلى اتباع بعض القواعد لإنشاء بناء rescuable: (ط) أي الجينات الجديدة التي ستدرج في جينوم NDV يجب أن يكون تحت سيطرة الإشارات المناسبة لالفيروسي RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي البلمرة. يجب إضافة هذه المتتاليات المنبع من إطار القراءة المفتوح الجديد (ORF) حتى بوليميريز يمكن التعرف على نهاية الجين السابق (GE) وبداية جديدة التحوير (GS)، متباعدة من جانب واحد النوكليوتيدات تسلسل بين الجينات (IG) . ينصح بإضافة كوزاك صالح (K) تسلسل لتحسين ترجمة حقيقية النواة الريباسي أيضا لتحسين بروتين الأجنبية التعبير ^32، (ب) النسخ المتماثل كفاءة NDV، كما لمعظم أعضاء الأسرة الفيروسات المخاطانية، تعتمد على طول الجينوم كونها متعددة من ³³ ستة، وبالتالي، فإن أي الإدراج في NDV أن يتبع هذا "حكم ستة". إذا لزم الأمر، مساالنيوكليوتيدات إضافية uired يمكن أن تضاف إلى المصب ORF جديدة، و (ج) يجب فحص تسلسل التحوير للعثور ممكن GE وGS مثل متواليات التي يمكن أن تضعف كفاءة الإنقاذ، والتعبير التحوير و / أو بقاء الفيروس. إذا كان موجودا، ويجب إزالة هذه تسلسلات الطفرات الصامتة. توليد المؤتلف طول كامل [كدنا] التالية القواعد المذكورة أعلاه هي الخطوة الأولى من أجل إنتاج بكفاءة NDV المعدلة وراثيا كما هو مفصل هنا.

في النظام جميع بنيات الحمض النووي هي تحت سيطرة الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 المروج (الشكل 3). يتم توفير هذه البلمرة حشوية في العابرة عن طريق عدوى مرافقة مع المؤتلف تعديل اللقاحية أنقرة فيروس (MVA-T7) ^34. إظهار الشكل 3A البلازميد pNDV-B1، التي بترميز كامل طول كدنا] antigenomic ^5. يبين الشكل 3B البلازميدات pTM1 ترميز NP، P و L ORFS. البلازميدات pCITE-GFP، الذي يشفر، شالتانجو المروج T7، وبروتين الفلورية الخضراء (GFP)، وpCAGGs GFP ^18، الذي يشفر نفس ORF تحت المروج الدجاج بيتا أكتين ^35، وتستخدم والضوابط. في هذا البروتوكول نقدم لك مجموعة من الإجراءات لإنقاذ المؤتلف NDV من [كدنا] من lentogenic NDV سلالة Hitchner B1 ⁵ (الشكل 4).