Summary

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Published: August 09, 2013
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Summary

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Abstract

Muitos vírus RNA evoluíram a capacidade para inibir a transcrição da célula hospedeira como um meio para contornar as defesas celulares. Para o estudo destes vírus, é, por conseguinte, é importante ter uma forma rápida e fiável de medir a actividade de transcrição em células infectadas. Tradicionalmente, a transcrição foi medida quer por incorporação de nucleótidos radioactivos tais como 3 H-uridina seguido por detecção através de autoradiograf ia ou contagem de cintilações, ou incorporação de análogos de uridina derivados halogenados tais como 5-bromouridine (BRU), seguido por detecção por imunocoloração. O uso de isótopos radioactivos, no entanto, exige equipamento especializado e não é viável em um certo número de configurações de laboratório, ao passo que a detecção de BrU pode ser complicado e pode sofrer de uma baixa sensibilidade.

A química clique recentemente desenvolvidos, o que envolve uma formação de triazole catalisada por cobre a partir de uma azida e um alcino, proporciona agora uma rápida e highly alternativa sensíveis a estes dois métodos. Instruções química é um processo de dois passos em que ARN nascentes é rotulado pela primeira vez por incorporação do análogo de uridina 5-etiniluridina (UE), seguido de detecção do rótulo com uma azida fluorescente. Estas azidas estão disponíveis como vários fluoróforos diferentes, permitindo uma grande variedade de opções para visualização.

Este protocolo descreve um método para medir a supressão de transcrição em células infectadas com o vírus da febre de Rift Valley (RVFV) estirpe MP-12, utilizando química do clique. Ao mesmo tempo, a expressão de proteínas virais nestas células é determinada por imunocoloração intracelular clássica. Etapas de 1 a 4 detalhar um método para visualizar supressão transcricional via microscopia de fluorescência, enquanto os passos 5 a 8 pormenor um método para quantificar a supressão da transcrição via citometria de fluxo. Este protocolo é facilmente adaptável para utilização com outros vírus.

Introduction

Tradicionalmente, a actividade de transcrição foi medida através da incorporação de qualquer radioactivos (3 H-uridina) 1 ou halogenados (BRU) em dois nucleósidos de ARN nascentes. Estes análogos de uridina são absorvidos pelas células, convertida em uridina-trifosfato (UTP), através da via de recuperação de nucleósido, e subsequentemente incorporada no ARN recém-sintetizado. 3H-uridina pode ser detectada por auto-radiografia, o que pode ser demorado, ou cintilação de contagem, o que requer equipamento especializado. Além disso, a utilização de isótopos radioactivos podem não ser prático em um certo número de configurações de laboratório, incluindo os de alta laboratórios biossegurança contenção. BrU pode ser detectada através de coloração imunológica com anticorpos anti-Bru, que podem exigir a permeabilização duras para garantir o acesso do anticorpo ao núcleo parcial ou desnaturação do ARN, com a estrutura secundária do ARN pode ser um impedimento estereoquímico à ligação de anticorpos.

_content "> O protocolo aqui descrito utiliza a recentemente desenvolvida clique química 3 para medir a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12. Instruções química baseia-se num cobre altamente selectivo e eficiente (I) catalisada por reacção de cicloadição entre um e alcino uma porção de azida de 4,5. Neste protocolo, o ARN nascentes em células infectadas é rotulado pela primeira vez através da incorporação de uridina analógico UE. Num segundo passo, o UE incorporado é detectado por meio de reacção com um azeto fluorescente. As principais vantagens deste método são (1) que não requerem a utilização de isótopos radioactivos e (2), que não requer a permeabilização dura ou desnaturação do ARN. Com um peso molecular de menos de 50 Da, o acesso da azida fluorescente não é impedida por insuficiente estrutura secundária permeabilização ou RNA. Além disso, os pesquisadores não estão limitadas na sua escolha de anticorpos primários ao combinar a detecção de ARN com uma classeimmunostaining iCal para proteínas virais.

Dois métodos diferentes são descritas neste protocolo: uma para a visualização de transcrição através de microscopia de fluorescência (passos 1-4), e uma para quantificar a transcrição através de citometria de fluxo (passos 5-8). Ambos os métodos combinam rotulagem de ARN nascentes com uma imunocoloração intracelular para as proteínas virais, o que permite estabelecer uma correlação entre a actividade de transcrição e infecção viral numa base célula-por-célula.

Os autores usaram com sucesso o protocolo aqui descrito para determinar a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12 6, as células infectadas com diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, e as células infectadas com o vírus da Toscana (TOSV) 10. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adaptado para ser utilizado com vírus diferentes e tem o potencial de ser modificado para incluir a coloração por imunofluorescência de proteínas virais ou celulares específicos.

Protocol

Análise da transcrição por microscopia de fluorescência 1. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE Coloque lamínulas redondas de 12 mm na placa de cultura de tecidos de 12 poços, uma lamela por poço. Nota: Se as células têm dificuldade em aderir a lamelas, casaco com poli-L-lisina (≥ 70.000 MW), antes de colocar em poços. Para este objectivo, lamelas submersas numa solução estéril de 0,1 mg …

Representative Results

A protea de NSS RVFV (Bunyaviridae família, género Phlebovírus) 11 inibe a transcrição geral da célula hospedeira através de dois mecanismos distintos: (i) por sequestrar a subunidade p44 do factor de transcrição basal TFIIH 11 e (ii), promovendo a degradação da p62 proteossômica subunidade de TFIIH 6. O RVFV MP-12 estirpe 13 de vacina tem sido usada para os experimentos descritos neste protocolo, desde MP-12 estirpe pode ser tratado em nível de …

Discussion

O protocolo fornecido descreve um método para medir o efeito da infecção virai em transcrição da célula hospedeira através da incorporação do análogo de uridina UE em ARN nascentes. Este método possui várias vantagens sobre os métodos anteriores: é rápido, sensível e que não contam com a utilização de isótopos radioactivos. Além disso, o método pode ser adaptado para se obter dados qualitativos através de microscopia de fluorescência ou de dados quantitativos através de citometria de fluxo, util…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos RB Tesh para fornecer o mouse policlonal anti-RVFV soro e M. Griffin da UTMB Citometria de Fluxo Núcleo Facilidade para obter ajuda com citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado por cinco U54 AI057156 através do Centro Regional de Excelência Ocidental, NIH concessão R01 AI08764301 e financiamento do Centro de Sealy de Desenvolvimento de Vacinas no UTMB.BK foi apoiado pelo Fundo de W. James McLaughlin Fellowship em UTMB.OL foi apoiado por R. Hilleman Early-Stage Investigator Award Carreira Maurice.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
5-ethynyl-uridine Berry & Associates PY 7563 dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips Fisherbrand 12-545-82  
5 ml polystyrene tubes BD Biosciences 352058  
Actinomycin D (ActD) Sigma 9415 dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen A-11029  
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz sc-2323  
CuSO4 Sigma C-8027 dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI Sigma D-9542 dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen 11965092  
FBS Invitrogen 16000044  
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) Invitrogen A10270  
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) Invitrogen A10277  
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01  
L-ascorbic acid Sigma A-5960 dissolve in H2O for 500 mM
paper filter VWRbrand 28333-087  
paraformaldehyde Sigma 158127  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
poly-L-lysine (MW ≥ 70000) Sigma P1274  
Triton X-100 Sigma T-8787  
Trizma base Sigma T-1503 dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056  
Fluorescence Microscope     e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer     e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

References

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Head, J. A., Ikegami, T. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (78), e50809, doi:10.3791/50809 (2013).

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