שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell
Summary
שיטה זו מתארת את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.
Abstract
רבים וירוסי RNA התפתחו היכולת לעכב שעתוק תא מארח כאמצעי לעקוף את ההגנות של סלולריות. לצורך המחקר של וירוסים אלה, ולכן חשוב לנו בצורה מהירה ואמינה למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים. באופן מסורתי, שעתוק כבר נמדד גם על ידי שילוב של נוקלאוזידים רדיואקטיביים כגון H-3 uridine אחרי גילוי דרך autoradiography או נצנץ ספירה, או שילוב של תולדות אנלוגים uridine כגון 5-bromouridine (BRU) ואחריו גילוי דרך immunostaining. השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים, לעומת זאת, דורש ציוד מיוחד ולא ריאלי במספר הגדרות מעבדה, תוך זיהוי של ברו יכול להיות מסורבל ועלול לסבול מרגישות נמוכה.
הכימיה לחץ שפותחה לאחרונה, הכוללת היווצרות triazole נחושת קטליזאטור מיזיד וalkyne, החברה מספקת מהירה וhighlחלופה רגישה Y לשתי השיטות הללו. לחץ כימיה היא תהליך שלב שני שבו RNA המתהווה הוא שהכותרת ראשונה על ידי שילוב של אנלוגי uridine 5 ethynyluridine (איחוד אירופי), ואחריו גילוי של התווית עם אזיד ניאון. azides האלה זמינים בכמה fluorophores שונה, המאפשר מגוון רחב של אפשרויות לשם ויזואליזציה.
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת דיכוי שעתוק בתאים נגועים בנגיף קדחת בקעת (RVFV) מתח MP-12 באמצעות לחץ כימיה. במקביל, ביטוי של חלבונים נגיפיים בתאים אלה נקבע על ידי immunostaining תאי הקלסית. שלבי 1 עד 4 פירוט שיטה לדמיין דיכוי תעתיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואילו שלבי 5 עד 8 פירוט שיטה לכמת דיכוי תעתיק באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא להתאמה בקלות לשימוש עם וירוסים אחרים.
Introduction
באופן מסורתי, פעילות תעתיק כבר נמדד באמצעות שילוב של שני רדיואקטיבי (H-3 uridine) 1 או הלוגנים (BRU) 2 נוקלאוזידים לרנ"א המתהווה. אנלוגים uridine אלה נלקחו על ידי תאים, הוסבו uridine-אדנוזין (UTP) דרך מסלול ההצלה nucleoside, ושולבו לאחר מכן לתוך RNA מסונתז חדש. ניתן לאתר 3 H-uridine ידי autoradiography, שיכול להימשך זמן רב, או נצנץ ספירה, אשר דורש ציוד מיוחד. יתר על כן, השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים לא יכולים להיות מעשי במספר הגדרות מעבדה, כולל מעבדות בטיחות ביולוגיות הכלה גבוהה. ניתן לאתר באמצעות ברו immunostaining עם נוגדנים נגד ברו, אשר עשוי לדרוש permeabilization הקשה כדי להבטיח גישה של הנוגדן לגרעין או denaturation החלקית של רנ"א, כמבנה המשני RNA עשוי להיות הפרעה סטרית לכריכת נוגדנים.
_content "> הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את הכימיה לחץ פיתחה לאחרונה לחץ כימיה 3 למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12. מסתמכת על נחושת סלקטיבי והיעילה ביותר (אני)-catalyzed תגובת cycloaddition בין alkyne ו מחצית אזיד 4,5. בפרוטוקול זה, RNA המתהווה בתאים נגועים שכותרתו ראשונה באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי. בשלב שני, האיחוד האירופי Incorporated הוא זוהה באמצעות תגובה עם אזיד ניאון. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) שהיא אינה דורשת את השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ו( 2) שהיא אינה דורשת permeabilization הקשה או denaturation של רנ"א. עם משקל מולקולרי של פחות מ -50 דא, גישה של אזיד הניאון לא הקשתה על ידי מספיק permeabilization או RNA מבנה המשני. יתר על כן, חוקרים אינם מוגבלים בבחירתם של נוגדנים עיקריים כאשר שילוב זיהוי של RNA עם כיתהimmunostaining iCal לחלבונים ויראליים.שתי שיטות שונות מתוארות בפרוטוקול זה: אחת להמחשת שעתוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (צעדים 1-4), ואחד לכימות שעתוק באמצעות cytometry זרימה (שלבים 5-8). שתי שיטות אלה משלבות תיוג של רנ"א המתהווה עם immunostaining תאי לחלבונים נגיפיים, המאפשר למתאם בין פעילות תעתיק וזיהום ויראלי על בסיס תא אחר תא.
החוקרים השתמשו בהצלחה בפרוטוקול שתואר כאן כדי לקבוע פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12 6, התאים נגועים במוטציות שונות MP-12, 9, 7,8 ותאים נגועים בנגיף טוסקנה (TOSV) 10. ניתן להתאים הפרוטוקול המתואר כאן בקלות לשימוש עם וירוסים שונים ויש לו את הפוטנציאל להיות שונה כדי לכלול מכתים immunofluorescence של חלבונים נגיפיים או סלולריים ספציפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול סיפק מתאר שיטה למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בשעתוק תא מארח באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי לרנ"א המתהווה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות קודמות: הוא מהיר, רגיש, ושאינו מסתמך על השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. יתר על כן, ניתן להתאים את ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים RB Tesh למתן העכבר polyclonal אנטי RVFV נסיוב ומ 'גריפין של מתקן Core cytometry זרימת UTMB לעזרה עם cytometry הזרימה. עבודה זו נתמכה על ידי 5 U54 AI057156 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס, מענק NIH R01 AI08764301, ומימון ממרכז Sealy לפיתוח חיסון בUTMB.BK נתמכה על ידי מלגת קרן מקלפלין וו ג'יימס בUTMB.OL נתמכה על ידי פרס מוריס הילמן ר 'בשלב מוקדם בקריירה חוקר.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
