Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen
Summary
Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.
Abstract
Viele RNA-Viren haben die Fähigkeit, Transkriptions-Wirtszelle als ein Mittel, um zelluläre Abwehrmechanismen zu umgehen hemmen entwickelt. Zur Untersuchung dieser Viren ist es daher wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Messung der Transkriptionsaktivität in infizierten Zellen. Traditionell wurde die Transkription entweder durch Einbau von radioaktivem Nukleoside wie 3 H-Uridin gemessen gefolgt von einem Nachweis über Autoradiographie oder Szintillationszählung oder Integrieren halogenierten Uridin-Analoga, wie 5-Bromuridin (BRU) durch Detektion mittels Immunfärbung gefolgt. Der Einsatz von radioaktiven Isotopen, erfordert jedoch spezielle Geräte und ist nicht in einer Reihe von Labor-Einstellungen durchführbar, während die Erkennung von BrU kann mühsam sein und können von niedriger Empfindlichkeit leiden.
Die neu entwickelte Klick-Chemie, die eine Kupfer-katalysierten Triazol-Bildung aus einem Azid und einem Alkin beinhaltet, bietet jetzt eine schnelle und highly sensitive Alternative zu diesen beiden Methoden. Klick-Chemie ist ein zweistufiger Prozess, in dem im Entstehen begriffenen RNA zunächst durch den Einbau des Uridin analogen 5-Ethinyluridin (EU), durch Detektion der Markierung mit einem fluoreszierenden Azid gefolgt markiert ist. Diese Azide sind als verschiedene Fluorophore, so dass für eine breite Palette von Optionen für die Visualisierung.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transkription Unterdrückung in Zellen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12 mit Klick-Chemie infiziert zu messen. Gleichzeitig wird die Expression der viralen Proteine in diesen Zellen durch klassische intrazellulären Immunfärbung bestimmt. Schritte 1 bis 4 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, während die Schritte 5 bis 8 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions via Durchflusszytometrie quantifizieren. Dieses Protokoll ist leicht an die Verwendung mit anderen Viren.
Introduction
Traditionell wurde Transkriptionsaktivität durch Einbau von entweder radioaktiv (3 H-Uridin) 1 gemessen worden oder halogenierte (BRU) 2 Nukleoside in entstehenden RNA. Diese Uridin Analoga werden von Zellen aufgenommen, umgewandelt in Uridin-Triphosphat (UTP) durch das Nukleosid Salvage Pathway, und anschließend in neu synthetisierte RNA eingebaut. 3 H-Uridin durch Autoradiographie, die sehr zeitaufwändig sein kann, oder Szintillations erkannt werden Zählen, das erfordert spezielle Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Verwendung radioaktiver Isotope nicht in einer Reihe von Laboreinrichtungen praktisch, einschließlich High-Containment biologische Sicherheit Laboratorien. BrU durch Immunfärbung mit Anti-Bru Antikörper, die die harten Permeabilisierung erfordern können, um den Zugriff des Antikörpers an den Kern oder teilweise Denaturierung von RNA, wie RNA Sekundärstruktur kann eine sterische Hinderung für die Antikörperbindung zu gewährleisten detektiert werden.
_content "> Das hier beschriebene Protokoll nutzt die kürzlich entwickelte klicken Chemie 3 bis transkriptionelle Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 infiziert zu messen. Klicken Chemie beruht auf einer sehr selektiven und effizienten Kupfer (I)-katalysierten Cycloaddition zwischen einem Alkin und einer Azid 4,5. In diesem Protokoll wird naszierenden RNA in infizierten Zellen zuerst durch Einarbeitung des Uridin analoge EU bezeichnet. In einem zweiten Schritt die inkorporierte EU durch Umsetzung mit einem Azid Fluoreszenz detektiert wird. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind (1), dass sie nicht die Verwendung von radioaktiven Isotopen und (2), dass es nicht erforderlich harten Permeabilisierung oder Denaturierung von RNA. mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 Da der Zugang des fluoreszierenden Azid nicht ausreichend behindert Permeabilisierung oder RNA Sekundärstruktur. Darüber hinaus sind die Forscher nicht in der Wahl ihrer primären Antikörper begrenzt, wenn die Kombination der Detektion von RNA mit einer KlasseiCal Immunfärbung für virale Proteine.Zwei verschiedene Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben: eine für die Visualisierung Transkription über Fluoreszenzmikroskopie (Schritte 1-4) und eine zur Quantifizierung der Transkription durch Durchflusszytometrie (Schritte 5-8). Beide Methoden kombinieren entstehender RNA Markierung mit einem intrazellulären Immunfärbung für virale Proteine, die für eine Korrelation zwischen Transkriptionsaktivität und Virusinfektion einer Zelle-für-Zelle-Basis ermöglicht.
Die Autoren haben sich erfolgreich verwendet das Protokoll hier beschriebenen transkriptionellen Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 6 Zellen mit verschiedenen MP-12-Mutanten 7,8, 9, und Zellen mit Toscana-Virus (TOSV) 10 infiziert infiziert zu bestimmen. Die hier beschriebene Protokoll kann leicht für die Verwendung mit verschiedenen Viren angepasst und hat das Potential, modifiziert Immunfluoreszenzfärbung spezifische virale oder zelluläre Proteine umfassen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die bereitgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Wirkung der viralen Infektion Wirtszelle die Transkription durch den Einbau des Uridin analoge EU in naszierenden RNA zu messen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber früheren Verfahren: schnell, empfindlich, und es muss nicht auf die Verwendung von radioaktiven Isotopen verlassen. Darüber hinaus kann das Verfahren angepasst ist, um qualitative Daten durch Fluoreszenzmikroskopie oder quantitative Daten über Durchflusszytometrie unter Verwendung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei RB Tesh für die Bereitstellung der Maus polyklonalen anti-RVFV Antiserum und M. Griffin des UTMB Durchflusszytometrie Core Facility für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde von 5 U54 AI057156 durch die Western Regional Center of Excellence, NIH R01 AI08764301 und Mittel aus dem Center for Vaccine Sealy Development bei UTMB.BK unterstützt wurde durch den James W. McLaughlin Fellowship Fund bei UTMB.OL wurde abgestützt durch eine Maurice R. Hilleman Frühe-Phase Karriere Investigator Award.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
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