構造化されたプロトコルは、細胞誘電分光法(CDS)を用いて、特発性脊柱側弯症の予後を予測するための機能テストのような細胞ベースのアッセイのために提示される。アッセイは、新鮮または凍結末梢血単核細胞(PBMC)を用いて行うことができ、手順は4日以内に完了する。
このプロトコルは、無症候性および影響を受けた小児の特発性側弯症の予後を予測するための機能テストとして、我々の研究室で開発された細胞ベースのアッセイのための実験や分析手順を詳しく説明します。アッセイは、自動化されたCDSベースの器具を用いて、細胞誘電分光法(CDS)による末梢血単核細胞(PBMC)中の王とGsタンパク質の機能的状態の評価から構成され、3つの官能基への子供の分類(FG1王およびGSタンパク質刺激に対する反応の程度との間の不均衡のプロフィールに関しては、FG2、FG3)。分類は、さらに、グループ間のGiの刺激に対する応答にオステオポンチン(OPN)の差動効果により確認されると、疾患の重症進行は、FG2によって参照される。およそ、10mlの血液の体積は、フィコール勾配および細胞のPBMCを抽出するために必要とされるその後液体窒素中に保存されている。 Pの適切な数BMCは、アッセイを行うためには、細胞培養の2日後に得られる。本質的に、細胞を最初にphytohemmaglutinin(PHA)と共にインキュベートする。 24時間のインキュベーション後、培地を細胞播種およびOPN処理の前にさらに24時間、PHAを含まない培地によって置き換えられる。次いで、細胞をそれぞれ分光それらの同族受容体を介して王とGsタンパク質を活性化ソマトスタチンおよびイソプロテレノールに対する応答についてスクリーニングする。ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの両方を同時に統合された流体システムを注射し、細胞の回答を15分間モニターされる。アッセイは、新鮮または凍結したPBMCを用いて実施することができ、手順は4日以内に完了する。
特発性脊柱側弯症は、一般的に、椎回転1を伴って10度以上横曲率と定義され、原因不明の脊柱変形である。条件は、小児集団の4%に影響を与え、最も一般的には9〜13歳の年齢2,3,4の間に診断される。診断は主に排除され、唯一のそのような椎骨の奇形、神経筋または症候性障害などの脊柱変形の他の原因を除外した後に行われている。伝統的に、trunkal非対称性はアダムス前進曲げ試験により明らかにし、身体検査中に5 scoliometerで測定する。診断は、次いで放射線曲線の観察およびコブ方法6を用いて角度測定により確認することができる。
診断されたら、脊柱側の子を管理する上で、医師のための主な関心事は、カーブが進行するかどうかである。確かに、カーブの進行は、多くの場合、予測不可能であり、より頻繁に男児7よりも女の子の間で観察されている。未治療の場合、曲線はかなりの物理的な変形、さらには心肺問題を作成、劇的に進行することができます。曲線は70°8,9を超えた場合に、これらの症状は、生命を脅かすになる。カーブの進行を防ぐか、または停止する現在の治療の選択肢は、ブレーシングや手術を含む。手術は曲線よりも大きい45°またはブレースに反応しないために予約されている間、一般的に、ブレーシングは、25〜40°の間のカーブをお勧めします。
およそ、特発性側弯症と診断された子供の10%は矯正手術10を必要とするカーブの進行を持っている。現在、実証済みの方法や患者のこのカテゴリを識別するために利用できるテストは存在しない。その結果、すべての診断された子供は、彼らが、骨格成熟に達するまでは、通常、数年にわたって複数のX線写真を受ける。これは、脊柱側弯症と、典型的な患者が持っていると推定されている3年間で11以上の約22放射線検査。そのため、複数のX線撮影検査の潜在的なリスクのため、電離放射線に子供をさらすことなく、特発性側弯症の予後を実施する可能性があり、代替のアプローチが強く望まれている。この必要性を満たすことを意図して、我々は、以前より早く特発性脊柱側弯症を発症するリスクが無症候性子供を識別するための予後試験として、細胞ベースのスクリーニングアッセイを開発した。試験はGiのタンパク質の機能状態を調べ、CDSによって測定されるのGiタンパク質刺激12に対する最大応答の程度に応じて3つの官能基(FG1、FG2及びFG3)中に子供を分類することによって、両方の無症候性および影響を受けた小児の臨床転帰を予測するベースのシステム。このシステムは、主に様々な細胞型13,14,15,16におけるGタンパク質を介してシグナル伝達を評価するために使用される。なおに関する情報を得る細胞表面受容体の活性化後のインピーダンスの変化を測定することにより、外部刺激に対する細胞の全積分応答。細胞をウェルの底に電極を含み、システムが細胞外および細胞間に電流を誘導する小さな電圧を印加することは、マイクロプレートに播種する。ウェルへの化合物の注射後、細胞表面受容体を刺激し、シグナル伝達事象が発生し、細胞外および細胞間の電流の流れに影響を与える細胞変化をもたらすことにより、測定された大きさに影響を与えている。健常対照被験者と比較した場合に、このアプローチでは、脊柱側弯症を発症する危険性のある脊柱側弯症の患者および子供以上がGiのタンパク質刺激にあまり反応であり、分類は、対照群と還元の相対的な程度の割合に基づいている。分類範囲はFG3、40及びFG2 60%、および60と12 FG1 90%、10〜40%の間で固定されている。
<p claSS = "jove_content">最近では、我々は3つの官能基は明らかに王およびGS刺激に対する応答との間の不均衡のプロファイルに応じて区別することができることを実証することで、このアプローチを変更しました。実際に、我々は、明らかな不均衡がFG2において観察されなかったGiの刺激に対する応答は、FG3で優勢であることを見出した。対照的に、FG1は、Gsを刺激に応答するための優位性を示した。加えて、我々はFG2に属する患者は手術を必要とする17の点に進行するリスクがより多くあるという証拠を提供した。この分類試験の精度をさらに官能基のうちGiの刺激に対する応答にオステオポンチン(OPN)の異なる効果を実証することによって改善されている。ここでは、現在我々の研究室で行われ、この機能試験の実験や分析法の詳細な手順を文書化する。
我々は、末梢血単核細胞にも適用可能である特発性脊柱側弯症(PBMC)を、新たに単離された、または液体窒素中で最長1年間凍結保存されたための細胞ベースの予後試験の詳細な手順を記載している。多数の個人をテストする際に、新たに単離したPBMCを使用することは面倒ですので、手順が臨床の場でより実用的な代替手段を提供する凍結したPBMCと発表されました。凍結したPBMCを最初にアッセイ間変動することが時々リードする、使用されたときが、解凍時の細胞凝集に問題が発生しました。アッセイの再現性を最大化するために、我々は、凍結融解サイクルを回避し、一度だけ凍結したサンプルを使用することをお勧めします。手順は、短時間で欠陥のある王タンパク質機能の正確な検出を可能にし、非常に簡単です。この手順を使用して、無症候性脊柱側の子供が簡単に、より自分の健康のために危険なしに臨床転帰を予測するために分類することができます。ホー健常者12に対して王刺激に対する最大反応の程度に応じて分類を行う、対照被験者のためのいくつかの要件を満たさなければならwever、。実際、適切な比較コホートを持つために、対照被験者は、薬のどのような種類でも、このような過去の家族/個々の病歴などの個人情報を提供しない、一致した年齢と性別でなければなりません。これらの要件は、対照被験者の動員のための重要な障害を構成することができる。したがって、同一個体における王とGsタンパク質刺激に対する応答との間の不均衡の程度を調べることにより分類を行うことにより、制御対象を使用する必要性を排除することが理想的である。
この予後テストを実行するには、CDSベースのシステムを使用すると、同時に同じアッセイで王とのGs媒介細胞応答を提供するという点で重要である。多くの患者は無AMで分類することができますが本報告書の結果によって示されるように、このアッセイのために固定されたダイナミックレンジを用いて、あいまいさは、少数の患者は、範囲の境界線での値を示すことになる。これらの個人を識別するために、我々は、OPNは、3つの官能基間のGiを媒介細胞応答に異なる効果を誘導することを実証することによって、Giの刺激に対する応答にOPNの効果の評価を導入している。実際に、我々は、OPN、FG1内のGiの刺激増大に応答して、の存在下では、FG2内のより高い程度まで、FG2及びFG3に減少することを見出した。 OPNの高いコストにもかかわらず、このケモカインの使用は、あいまいな場合を区別するため、我々の分類アッセイの精度を向上させることが不可欠である。しかし、このアッセイは、ウェル当たり1.5×10 5個の細胞の最小は、我々の実験条件下でCDSベースのシステムで細胞応答を観察するために必要とされるという欠点を有する。特定の患者サンプルは、十分な数を持っていません試験されるべき細胞。この場合には、医療や研究室スタッフ、家族やイライラするために気になることができる追加の採血のために患者をリコールする必要がある。前向き研究は、この問題に対処するために我々の研究室で予定されています。
それにもかかわらず、現在のプロトコルは、テストが細胞の応答をモニターするために検証済みラベルフリーシステム13,14を使用して自動化している間の細胞を調製するために、簡単で実証された方法に依存している。他の疾患の予後のための利用可能な遺伝的プラットフォームと比較した場合、テストプラットフォームは、比較的安価である。また、採血管を含む全ての使い捨て材料利用のコストは、特別な電極マイクロプレート、円錐、エッペンドルフ管は、非常に高価ではなく、約1000人の患者の試験を完了するために、以下で3000ドルと見積もられている。この推定値は、サンプルの調製のための人件費が含まれていませんが及び試験を行う、このテストはかなり手頃な次世代シークエンシングプラットフォームよりも残る。注目すべきは、遺伝的なプラットフォームへのコスト比較だけではありませんが、より具体的には、AISの分野に関連し、核医学診断に関連するコストである。今日では、米国内の1万人の子どもたちとカナダでは約100,000の子どもよりも、特発性側弯症と診断されており、X線照射による脊柱側の子どもの診断およびモニタリングの総費用は、北米で毎年25億ドル以上である。したがって、我々の細胞ベースのアッセイ手順は、健康上のリスクがなく、低コストで特発性脊柱側弯症児の日常的なスクリーニングおよびモニタリングに適していると予想される。
The authors have nothing to disclose.
この作品は(ドクター·モロー)はラ·財団イヴCotrelドゥフランス学士院、パリ、フランスからの補助金によって支えられて、健康の研究のカナダの協会は(ドクター·モローにPP2-99466を付与)し、四次元脊椎LLCから米国ニューヨーク州(ドクター·モローの研究助成金)。
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |