结构化协议提出了一个基于细胞的检测作为一个功能测试使用的细胞介电谱(CDS)来预测特发性脊柱侧凸的预后。该测定法可以与新鲜或冷冻的外周血单核细胞(PBMC)来执行,该过程是在4天内完成。
这个协议的细节的实验和分析方法在我们实验室开发的作为功能性测试来预测无症状和受影响儿童特发性脊柱侧凸的预后基于细胞的测定法。该法由Gi和GS通过细胞介电谱(CDS)的蛋白质在外周血单个核细胞(PBMC)的功能状态的评价,使用自动化的CDS为基础的仪器,和儿童的分类成三个官能团(FG1 ,FG2,FG3)相对于不平衡响应于Gi和GS蛋白刺激的程度之间的轮廓。该分类是由骨桥蛋白(OPN)对反应组和疾病的严重恶化被引用FG2游戏王之间的刺激效果差进一步证实。大约为10毫升的血液的体积,需要通过Ficoll梯度和细胞中提取的PBMC,然后在液氮中保存。 P的足够数量的骨髓细胞进行检测后,被细胞培养两天获得的。本质上,将细胞先孵育phytohemmaglutinin(PHA)。经过24小时培养后,培养基被替换为一个的PHA的无培养基进行24小时前,细胞接种和OPN治疗。细胞,然后光谱筛选他们的反应,生长抑素和异丙肾上腺素,通过其同源受体分别激活Gi和GS蛋白。既生长抑素及异丙肾上腺素同时注入带有集成流体系统和细胞的响应被监测15分钟。该法可以用新鲜或冷冻的外周血单个核细胞进行,并且该过程在4天内完成。
特发性脊柱侧弯是一种原因不明的脊柱畸形一般定义为侧向弯曲大于10度伴有椎体旋转1。这种状况影响了儿科人口的4%,是9至13岁2,3,4岁之间最常见的诊断。诊断主要是一种排斥,只有在排除了脊柱畸形的其他原因,如椎畸形,神经肌肉综合征或疾病作出。传统上,trunkal不对称性是由亚当斯向前弯曲试验发现,并在体检5与测量计测量。诊断然后可通过放射线照相观测的曲线,并使用科布方法6中的角度测量来确认。
一旦确诊,医生在管理侧凸儿童主要关注的是曲线是否会取得进展。事实上,侧凸进展往往是不可预测的,比7男生更频繁地在女孩中观察到。如果不经治疗,曲线可以显着进步,创造显著身体畸形,甚至心肺的问题。这些表现成为当曲线超过70°8,9危及生命。目前的治疗方案,以防止或阻止侧凸进展包括支撑和手术治疗。在一般情况下,支撑被推荐用于在25-40°之间的曲线,而手术是保留曲线大于45°或不响应支撑。
约,确诊为特发性脊柱侧弯的孩子10%有曲线进展,需要矫正手术10。目前,还没有有效的方法或测试可用来识别这类病人。因此,所有确诊儿童受到多重X光片在数年内,通常直到他们到达骨骼成熟。据估计,在典型患者的脊柱侧凸将有约22放射学检查在3年的时间11。由于多个影像学检查的潜在风险,替代方法,可以让不暴露孩子于电离辐射进行特发性脊柱侧凸的预后是非常可取的。随着满足这一需求的意向,我们以前开发一个基于细胞的筛选试验作为预后测试越早确定无症状儿童在发展特发性脊柱侧凸的风险。该测试预计在无症状和影响的儿童的临床结果通过检查Gi蛋白的功能状态,并根据对Gi蛋白刺激12最大响应程度由CDS衡量孩子分成三官能团(FG1,FG2和FG3)为基础的系统。这个系统主要是用来通过G蛋白在各种细胞类型13,14,15,16,以评估信号转导。它产生有关的信息细胞通过以下细胞表面受体的活化测量阻抗的变化总集成响应于外部刺激。细胞被接种到微孔板包含电极的孔的底部,并且系统施加一个小电压诱发的细胞外和跨细胞电流。下列化合物注入到井中,细胞表面受体被刺激和信号转导事件的发生,从而导致影响细胞外和跨细胞电流的流动细胞的变化,进而影响测量的幅度。通过这种方法,脊柱侧凸患者和儿童更是发展脊柱侧弯的风险是当与健康对照组相比,较不响应能力Gi蛋白的刺激,而分类是基于减少相对于对照组的程度的百分比。该分类范围是固定的10至40%为FG3,40和FG2 60%,60至90%为FG1 12。
<p claSS =“jove_content”>最近,我们通过证明三个官能团可以清楚地根据不平衡响应Gi和GS刺激之间的配置区别修正了这一做法。事实上,我们发现,反应在GI刺激FG3为主,而没有明显的不平衡,观察FG2。相比之下,FG1展出优势为响应GS刺激。此外,我们提供的证据,属于FG2患者更在发展到需要手术的17点的风险。这种分类测试的精度还进一步通过在响应中的官能团游戏王刺激显示出骨桥蛋白(OPN)的差动作用得到改善。在这里,我们介绍的是目前在我们的实验室进行这种功能测试的实验和分析程序的详细步骤。
我们已经描述了基于细胞的预后测试为特发性脊柱侧凸了适用于外周血单核细胞(PBMC)新鲜分离的或保守的急冻长达一年在液氮中的详细过程。由于测试大量的个人在使用新鲜分离的外周血单个核细胞是繁琐,程序提交了冷冻外周血单个核细胞,提供在临床上较为实际的选择。然而,存在的问题与解冻后细胞聚集时,冷冻的PBMC与最初使用时,有时会导致测定间变异遇到。为了最大限度地提高测定的再现性,建议避免冻融循环和仅使用一次的冷冻样品。该过程是很简单的,允许精确检测在短时间内有缺陷的Gi蛋白的功能。使用此程序,无症状和侧凸儿童可以很容易地划分,以更好地预测其临床结果不为他们的健康有任何危险。何WEVER,根据在GI刺激相对于健康对照组12最大响应程度进行分类时,应满足的对照组几个要求。事实上,为了有一个适当的比较队列,控制对象必须是年龄和性别匹配的,不会对任何种类的药物,并提供私人信息,如过去的个人/家族病史。这些要求可能构成对控制对象的招聘的一个重要障碍。因此,通过检查不平衡响应于Gi和Gs蛋白刺激在同一个体之间的相似度进行分类是理想的,以消除使用对照受试者的必要性。
使用CDS为基础的系统来执行此测试的预后是在同时提供游戏王和GS-介导的细胞应答在相同的测定条件显著。尽管许多患者可分为无时biguity使用动态范围定为这个实验中,有少数病人会在范围的边缘表现出值,就说明了本报告中的结果。歧视这些人,我们通过证明OPN诱导的三官能团之间的游戏王介导的细胞反应差效应引入的OPN效果的评估上反应在GI刺激。事实上,我们发现,在骨桥蛋白,响应于游戏王刺激增加FG1,的存在,而它在FG2和FG3减小,在FG2更高的程度。尽管OPN成本高,使用这种趋化因子是十分必要的区分不明确的情况下,因此提高我们的分类分析的准确性。然而,这种试剂盒中,最低每孔1.5×10 5个细胞的需要我们的实验条件下观察到的细胞反应和CDS为基础的系统是不利的。某些患者样品不会有足够数量的细胞进行测试。在这种情况下,有必要回顾一下病人额外的血液采集,它可以是令人担忧的家庭和令人沮丧的医疗和实验室工作人员。前瞻性研究计划在我们的实验室来解决这个问题。
然而,目前的协议依赖于简单而行之有效的方法来制备细胞,而测试是使用经过验证的无标记系统13,14来监测细胞的反应自动化。用时可用于其他疾病的预后遗传平台相比,测试平台是相对便宜的。此外,所有的一次性材料,包括血液收集管,技巧,特殊电极微孔板,和圆锥形和Eppendorf管的成本,是不是很昂贵,估计少于3,000元,完成约千术测试。虽然这个估计不包括样品制备人工成本并进行测试,这个测试仍然大大高于新一代测序平台的更多实惠。值得注意的是,不仅是成本比较遗传平台上,但更具体地涉及到AIS的领域中,是关联到辐射成像的费用。今天,在美国超过一百万的儿童和在加拿大大约10万名儿童被诊断为特发性脊柱侧凸,以及诊断和监测脊柱侧凸儿童用X射线照射的总成本每年超过250十亿美元在北美。因此,我们的细胞为基础的检测程序,预计将适用于常规筛查和监测儿童特发性脊柱侧凸没有健康风险,并以更低的成本。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了补助金从La伊夫基金会Cotrel的DE L'法兰西学院,巴黎,法国(以莫罗博士)的支持,健康研究加拿大学院(授予PP2-99466到莫罗博士),并从第四维脊椎有限责任公司,New York,美国(研究经费莫罗博士)。
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |