Een gestructureerd protocol wordt gepresenteerd voor een cel-gebaseerde test als een functionele test om de prognose van idiopathische scoliose te voorspellen met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS). De test kan worden uitgevoerd met vers of ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en de procedure binnen 4 dagen.
Dit protocol geeft de experimentele en analyseprocedure voor celgebaseerde assay ontwikkeld in ons laboratorium als een functionele test voor de prognose voor idiopathische scoliose bij asymptomatische en getroffen kinderen voorspellen. De test bestaat uit de evaluatie van de functionele status van Gi en Gs eiwitten in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) door cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS), met een geautomatiseerde CDS gebaseerde instrument, en de indeling van de kinderen in drie functionele groepen (FG1 , FG2, FG3) met betrekking tot het profiel van onbalans tussen de mate van respons op Gi en Gs eiwitten stimulatie. De classificatie wordt verder bevestigd door het differentieel effect van osteopontine (OPN) op reactie op Gi stimulatie tussen de groepen en de ernstige progressie van de ziekte wordt verwezen door FG2. Ongeveer wordt een volume van 10 ml bloed nodig PBMC extraheren door Ficoll-gradiënt en cellen worden vervolgens opgeslagen in vloeibare stikstof. Het voldoende aantal PBMCS verrichten van de bepaling wordt verkregen na twee dagen van celkweek. In wezen worden cellen eerst geïncubeerd met phytohemmaglutinin (PHA). Na 24 uur incubatie wordt het medium vervangen door een PHA kweekmedium gedurende 24 uur voorafgaand aan zaaien van cellen en OPN behandeling. Cellen worden vervolgens spectroscopisch gescreend op hun reacties op somatostatine en isoproterenol, die respectievelijk activeren Gi en Gs proteïnen via hun verwante receptoren. Zowel somatostatine en isoproterenol gelijktijdig geïnjecteerd met een geïntegreerde fluïdica systeem en de reacties van de cellen 'worden gecontroleerd gedurende 15 minuten. De test kan worden uitgevoerd met vers of bevroren PBMCs en de procedure wordt afgerond binnen 4 dagen.
Idiopathische scoliose is een ruggengraat misvorming van onbekende oorzaak algemeen gedefinieerd als een laterale kromming groter dan 10 graden vergezeld van een wervel rotatie 1. De aandoening komt 4% van de pediatrische populatie en wordt meestal gediagnosticeerd in de leeftijd van 9 tot 13 jaar 2,3,4. De diagnose is in de eerste plaats van uitsluiting en wordt pas na het uitsluiten van andere oorzaken van vervorming van de wervelkolom, zoals vertebrale misvorming, neuromusculaire of syndromale aandoeningen. Traditioneel wordt de trunkal asymmetrie onthuld door Adams naar voren buigen testen en meten met Scoliometer tijdens lichamelijk onderzoek 5. De diagnose kan dan worden bevestigd door radiografische waarneming van de curve en de hoekmeting met Cobb methode 6.
Zodra de diagnose, de primaire zorg voor artsen in het beheer scoliotische kinderen is de vraag of de curve zal vorderen. Inderdaad, de karakteristieken hebben vaak onvoorspelbaar enis vaker waargenomen bij meisjes dan bij jongens 7. Indien onbehandeld, kan de curve drastisch vooruitgang, het creëren van belangrijke fysieke misvorming en zelfs hart-problemen. Deze manifestaties levensbedreigend worden indien de curve hoger is dan 70 ° 8,9. De huidige behandeling opties te voorkomen of te stoppen curve progressie onder schoren en chirurgie. In het algemeen, schrap wordt aanbevolen voor bochten tussen 25-40 °, terwijl chirurgie is gereserveerd voor bochten van meer dan 45 ° of niet reageren op schoren.
Ongeveer 10% van de kinderen met de diagnose idiopathische scoliose hebben karakteristieken hebben die voor corrigerende chirurgie 10. Momenteel is er geen bewezen methode of proef waarover deze categorie patiënten identificeren. Bijgevolg worden alle gediagnosticeerde kinderen onderworpen aan meerdere röntgenfoto's over meerdere jaren, meestal tot ze volwassen skelet bereiken. Geschat wordt dat de typische patiënten met scoliose zalongeveer 22 radiologische onderzoeken over een periode van 3 jaar 11. Vanwege het potentiële risico van meerdere radiografische onderzoeken, de alternatieve benaderingen waardoor het uitvoeren van de prognose van idiopathische scoliose zonder kinderen bloot te stellen aan ioniserende straling zijn sterk gewenst. Met de bedoeling om aan deze behoefte, hebben we eerder ontwikkelde een cel-gebaseerde screeningstest als een prognostische test om de asymptomatische kinderen sneller identificeren die risico lopen op het ontwikkelen van idiopathische scoliose. De test voorspelt klinische uitkomst zowel asymptomatische en getroffen kinderen door onderzoek van de functionele status van Gi eiwitten en classificeren kinderen in drie functionele groepen (FG1, FG2 en FG3) volgens de mate van de maximale respons op stimulatie Gi eiwitten 12 zoals gemeten door CDS -gebaseerd systeem. Dit systeem wordt voornamelijk gebruikt om signaaltransductie te beoordelen door middel van G-eiwitten in verschillende celtypes 13,14,15,16. Het levert informatie over detotale geïntegreerde respons van de cellen aan de externe stimuli door het meten van veranderingen in impedantie na de activering van celoppervlak receptoren. Cellen worden gezaaid in microtiterplaten die elektroden bevatten onder aan de putjes en het systeem past een kleine spanning die extracellulaire en transcellulaire duceren. Volgende verbinding injectie in de put worden celoppervlak receptoren gestimuleerd en signaaltransductie gebeurtenissen plaatsvinden, die tot cellulaire veranderingen die de stroom van extracellulaire en transcellulaire stromingen beïnvloeden en daardoor de gemeten grootte beïnvloeden. Met deze aanpak, de scoliotische patiënten en kinderen meer risico lopen op het ontwikkelen van scoliose zijn minder ontvankelijk voor Gi proteïne stimulatie in vergelijking met gezonde proefpersonen, en de indeling is gebaseerd op het percentage van de mate van reductie ten opzichte van controlegroep. De classificatie bereiken worden vastgesteld tussen 10 en 40% voor FG3, 40 en 60% voor FG 2, en 60 en 90% voor FG1 12.
<p class = "jove_content"> Meer recent hebben we deze aanpak gewijzigd door aan te tonen dat de drie functionele groepen duidelijk te onderscheiden op basis van het profiel van de onbalans tussen respons op Gi en Gs stimulatie. Inderdaad vonden we respons op stimulatie Gi overheerste in FG3, terwijl er geen duidelijke onbalans werd waargenomen in FG2. Daarentegen vertoonde FG1 overwicht het antwoord op Gs stimulatie. Daarnaast hebben we het bewijs dat patiënten uit FG2 lopen meer risico op progressie naar de punt van een noodzakelijke operatie 17 voorzien. De precisie van deze classificatie-test is verder verbeterd door aan te tonen een differentiële effect van osteopontine (OPN) op reactie op Gi stimulatie tussen functionele groepen.Hier leggen we de gedetailleerde stappen van experimentele en analytische procedures van deze functionele test zoals thans uitgevoerd in ons laboratorium.
We hebben een gedetailleerde procedure van cel-gebaseerde prognostische test voor idiopathische scoliose die voor perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) vers geïsoleerde of geconserveerd maximaal een jaar in vloeibare stikstof ingevroren beschreven. Aangezien met vers geïsoleerde PBMC omslachtig bij het testen groot aantal individuen, werd de procedure gepresenteerd bevroren PBMC die een praktischer alternatief klinische omgeving te bieden. Echter, problemen met de cel klonteren bij het ontdooien werden ondervonden bij ingevroren PBMCs werden aanvankelijk gebruikt, leidt soms tot inter-assay variabiliteit. Om assay reproduceerbaarheid te maximaliseren, raden we vermijden vries-dooi cyclus en slechts een keer met de bevroren monster. De procedure is zeer eenvoudig, waardoor een nauwkeurige detectie van defecte Gi eiwitfunctie in een korte tijd. Met deze procedure kan asymptomatisch en scoliotische kinderen gemakkelijk worden ingedeeld naar hun klinische resultaten beter te voorspellen zonder gevaar voor hun gezondheid. However, bij het uitvoeren indeling overeenkomstig de mate van de maximale respons op stimulatie Gi vergelijking met de gezonde proefpersonen 12 verschillende vereisten voor de controlegroep worden voldaan. Inderdaad, om een goede vergelijking cohort hebben, de controlegroep moet leeftijd en geslacht gematched zijn, niet op enige vorm van medicatie, en geven prive-informatie, zoals in het verleden individuele / familiale medische geschiedenis. Deze eisen kunnen een belangrijk obstakel voor de werving van proefpersonen vormen. Daarom is het uitvoeren van de indeling door het onderzoeken van de mate van onbalans tussen de respons op Gi en Gs eiwit stimulatie in dezelfde persoon is ideaal om de noodzaak van het gebruik controlepersonen elimineren.
Het gebruik van de CDS-systeem deze prognostische test is belangrijk in termen van de gelijktijdige toevoer van Gi-en Gs-gemedieerde cellulaire responsen in dezelfde assay. Hoewel veel patiënten kunnen worden ingedeeld zonder ambiguity behulp van het dynamische bereik voor deze test vast, een klein aantal patiënten zal waarden vertonen op de grens van de reeksen, zoals blijkt uit de resultaten van dit verslag. Om deze individuen onderscheiden, hebben we de evaluatie van het effect van OPN geïntroduceerd respons op stimulatie door Gi tonen dat OPN induceert een differentieel effect op Gi-gemedieerde cellulaire respons onder de drie functionele groepen. Inderdaad vonden wij dat in aanwezigheid van OPN, respons op stimulatie Gi toename FG1, terwijl afneemt in FG2 en FG3, een hogere mate FG2. Ondanks de hoge kosten van OPN, het gebruik van deze chemokine essentieel dubbelzinnige gevallen onderscheiden, en derhalve de nauwkeurigheid van onze assay indeling. Echter, deze test is een nadeel dat minimaal 1,5 x 10 5 cellen per putje vereist is om cellulaire respons waarnemen met de CDS-systeem onder onze experimentele omstandigheden. Bepaalde monsters patiënt voldoende niette testen cellen. In dit geval moet de patiënt extra bloedafname, die zorgelijk voor gezinnen en frustrerend voor de medische en laboratoriumpersoneel roepen. Prospectieve studies zijn gepland in ons laboratorium om dit probleem aan te pakken.
Toch is de huidige protocol is gebaseerd op eenvoudige en beproefde methoden om cellen te bereiden terwijl de testen wordt geautomatiseerd met behulp van een gevalideerde label-free-systeem 13, 14 om de reacties van de cellen te controleren. Het testplatform is relatief goedkoop in vergelijking met genetische platform vindt de prognose voor andere ziekten. Ook de kosten van alle beschikbare materialen, zoals de bloedafname buizen, tips, de elektrodekabel microplaten en conisch Eppendorf buizen, is niet erg duur en wordt geschat op minder dan $ 3000 een test ongeveer duizend patiënten voltooien. Hoewel deze schatting niet arbeidskosten voor de voorbereiding van de monsters bevattenen het uitvoeren van de test, deze test blijft aanzienlijk goedkoper dan next-generation sequencing platforms. Opmerkelijk is niet alleen de kosten ten opzichte van genetische platforms, maar meer specifiek op het gebied van AIS, de kosten voor radiologische beeldvorming. Vandaag, meer dan een miljoen kinderen in de VS en ongeveer 100.000 kinderen in Canada zijn gediagnosticeerd met idiopathische scoliose, en de totale kosten van diagnose en monitoring van de scoliotische kinderen door blootstelling X-ray is jaarlijks meer dan 2,5 miljard dollar in Noord-Amerika. Zo zou onze cel-gebaseerde test procedure worden verwacht geschikt voor routinematige screening en monitoring van kinderen met idiopathische scoliose zonder risico voor de gezondheid en tegen lagere kosten te zijn.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Parijs, Frankrijk (Dr Moreau), de Canadese Institutes of Health Research (verlenen PP2-99466 Dr Moreau) en vanaf Vierde Dimensie Spine LLC , New York, USA (Research subsidie aan Dr Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |