זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

ברוב הרקמות, תאים מובחנים תוחלת חיים מוגבלת. כדי לשמור על שלמות פונקציונלית, תאי גזע חיים ארוכים, רקמות ספציפיות ברציפות לייצר תאי אב שבתורו להצמיח תאים המובחנים באופן מלא הנדרשים לתפקוד של רקמה מסוימת. תאי גזע גם לחדש את התא שלהם באמצעות תהליך הנקרא התחדשות עצמית. לכן, תאי גזע אחראים לשמירה על השלמות הפונקציונלית של הרקמה שהם מתגוררים בי לכן, זוהי חובתו הם מצוידים במנגנונים חזקים כדי לחוש ואפשרות לתקן דנ"א פגום. אם לא, הם עשויים לרכוש הפרעות מרובות גנומית (מזיקים), אשר ניתן בירושה לצאצאיהם. הבנה כיצד תאי גזע בטוחים לשמור על הגנום שלהם במהלך תוחלת החיים של האורגניזם היא שאלה חשובה ועשויה לסייע לנו להבין מדוע חוסר יציבות גנומית מקושרת עם סרטן ומחלות אחרות הקשורות לגיל (הנסקרת ב ^1,2).

<p class = "jove_content"> שליטה שלמות גנטית של רקמות ברמה של תאי גזע או אוכלוסיות תאים ובתאים מוקדם יכול להיות מושגת על ידי ביטול או גזע פגום (או אב) תאים באמצעות מוות של תאים, הזדקנות או בידול, ו / או על ידי תיקון יעיל ה-DNA של ניזוק. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ניתן למדוד סוגים מסוימים של תיקון דנ"א ישירות באוכלוסיות נדירות אלה ^3-6. נמצא כי, למשל במערכת הדם, ניתן לתיקון הפסקות הדנ"א כפול גדיל ידי רקומבינציה הומולוגית (HR) או שאינו הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ), האחרון להיות תהליך תיקון של נאמנות נמוכה יותר ובכך הסיכון מוגבר לביצוע שגיאות. שניהם מנוצלים בתאי גזע hematopoietic (HSCs) ^4,5, לעומת זאת, בעכברים שזה נראה זה בעיקר NHEJ בHSCs ואילו תאי אבות מוקדם לנצל משאבי אנוש ^4. תצפית דומה נעשתה לתאי גזע בעור ^6. מעניין לציין, כי בבני HSCs משאבי אנוש, לא NHEJ,נראה שמנגנון התיקון של בחירה עבור הפסקות גדיל כפולות ^3. אם הבדל פונקציונלי בין שני המינים הוא אמיתי או רק מייצג את הבדל טכנולוגי או ניסיוני נותר לראות.

הרפרטואר של תאי גזע כדי לתקן דנ"א פגום צפוי לכלול מנגנוני תיקון DNA אחרים, כגון תיקון כריתת בסיס (BER), תיקון כריתת נוקלאוטיד (נר) ותיקון אי התאמה (MMR). BER והנר אחראים לתיקון נגעי זוג בסיס יחיד או מרובים ב-DNA חד גדילים, ואילו חוסר התאמה תיקוני MMR בסיס בסיס ולולאות הכנסה / מחיקה, אלו סוגים של נזק לדנ"א לא ניתן לתיקון על ידי NHEJ או משאבי אנוש. תמיכה ברעיון זה כמה מחקרים ממערכת hematopoietic הוכחת קשר בין שינויים באחד מהמסלולים האלה וליקויים בתא HSC ^7-9, כמו גם סיכון מוגבר לפתח תסמונת myelodysplastic ^10-16, מחלה שמקורה בHSC וכי הוא קשור עם עלייה בחוסר יציבות גנומית ככל שהמחלה מתקדמת ^17. כמו של עוד, מדידות של BER, נר, וMMR ישירות בHSCs לא דווחו.

בנוסף להבהרת התהליכים השונים השולטים בשלמות רקמות ברמה המכניסטית, זה הכרחי כדי שתוכל למדוד את המידה של ה-DNA שעבר מוטציה, כך שההשלכות של סטיות באחד מהתהליכים אלה ניתן לבדוק, למשל ברגילים לעומת גנטי תאי גזע מהונדסים או בישן מול צעיר. עם זאת, הפיתוח של assay רלוונטי הוא קשה בגלל המחסור בתאי גזע רקמות ספציפיות וחוסר תנאי תרבות המשמר את "stemness". יתר על כן, assay כזה צריך להיות amendable למניפולציות סביבתיות וגנטיות. פתרון אפשרי למגבלות ולדרישות הללו הוא השימוש במודלים של עכברים שהונדסו במיוחד כדי לזהות מוטציות בדנ"א.

מולמודלים עכבר מהונדסים טייפל לזיהוי מוטציה פותחו. לדוגמא, עכברים הטרנסגניים לאצי ¹⁸ לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת כתב לאצי, שבו גן מקודד לאצי מדכא של המפעיל לאק ומשמש ככתב המוטציה. עם המוטציה של הגן לאצי, מפעיל Lac מופעל וβ-galactosidase מיוצר. דבק β-galactosidase X-gal chromogenic המצע (5-bromo-4-כלורו-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), שהופך אותו כחול. Cos אתרי איגוף וקטור האצים מאפשר התאוששות קלה על ידי חלבוני הפאג מבדה והזיהום הבא של א ' coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את מצע X-gal, יכול להיות הבקיע הפלאק. שלטים כחולים מכילים מוטציה המשוערת לאק, אני נושא הפאג, ואילו הפלאק ברור נמל שאינם מוטציות. התדר של שלטים כחולים (בין הדואר ברור אלה) מציין את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA שמופקת. יתר על כן, הפאג λ אירוח יעד האצים יכול להיות רצף בקלות באמצעות טכניקות PCR לניתוח תפוקה גבוהה יחסית. רצף הגנים של אצי מוטציה מרובים יחשוף מידע חשוב על ספקטרום המוטציה, אשר בתורו עשוי להצביע על ליקויים אפשריים במסלולי תיקון DNA ספציפיים או לאירועי genotoxic ספציפיים. המערכת המהונדס האצים כבר טופל בכל מעבדות מרובות ¹⁹ והחומרים הכימיים זמינים באופן מסחרי. חסרון עיקרי אחד של המערכת לאצי הוא היכולת המוגבלת לגילוי מחיקות או שחלופים גדולים, ולכן, בשיטות אחרות, כגון דגי צבע רב על מרווחי metaphase צריכים לשמש כדי להחמיא מחסור זה.

בתוך וקטור הפאג λ של מודל עכבר לאצי, יש גן קטן בהרבה, כת"ש, זמין עבור ניתוח מוטציה. הגודל שלה והעובדה שניתן לבחור מוטציות שעושים את זה assay עתיר עבודה וזולה פחות ²⁰ מהניתוח הגנטי לאצי. עם זאת, את הגן לאצי הוא למד באופן נרחב יותר לmutagenesis ²¹ והרגישות של הגן למוטציות כבר מאופיין היטב, כך שיש הבנה ברורה של שאריות חומצת אמינו שיוצרות תגובת פנוטיפי על מצע chromogenic ^22-25.

דגמי עכבר אחרים לזיהוי מוטציה לכלול את השימוש של ΦX174 או transgenes LacZ. מודל ΦX174 המהונדס העכבר, עם המקורי: T → G: מוטציה חזרה C assay ²⁶ או assay המוטציה קדימה ²⁷ המאפשר זיהוי של ספקטרום של החלפות זוג בסיס, מייצג מערכת פחות יקרה מאשר המודל לאצי. עם זאת, מסך מוטאציות בassay קדימה אינו טריוויאלי ומפרט המוטציהמוסטרום של transgene ΦX174 לא כמאופיין היטב כמו זה של לאצי. במודלים של עכברים שנשאו transgenes LacZ, כתב מוטאציות LacZ הוא התאושש ניצול E. תאי מארח coli שרגישים לגלקטוז ובינוני המכיל גלקטוז ^28. חסרון של שיטה זו הוא שהתאוששות של יעד LacZ כרוך גם עיכול endonuclease הגבלה ואחרי קשירה וelectroporation של א ' coli מארח, ובכך הופך אותו קשה להתאים את המערכת למספר קטן של תאים. למרות זאת הוא לא דרישה מוחלטת לעבודה עם אוכלוסיות תאי גזע / אב (תמיד אפשר להתחיל עם יותר עכברים), אם מספר גדול של תאים נדרשים (לדוגמא במיליונים או יותר) זה יהיה לא מעשי ועלות אוסרני במהירות. כמו כן, הגודל גדול יחסית של LacZ, תוך מתן כתב מוטאציות רגיש, הוא מסורבל ויקר יותר לניתוח רצף ה-DNA וdetermination של ספקטרום מוטציה. יתרון עיקרי של מודל זה לעומת זאת, הוא יכולתה לזהות מחיקות והוספות גדולות, כמו גם שחלופים בכרומוזומים.

מכיוון שכל התאים במודלי העכבר מהונדסים לאצי, ΦX174 וLacZ לשאת את המערכת העיתונאית, כל אחד ממודלים של עכברים אלה יכול לשמש למדידת mutagenesis בכל סוג תא של עניין, כולל בתאי גזע ואב, כל עוד הם יכולים להיות שנקטפו באופן מהימן ובכמות מספקת. כי היו לנו ניסיון רב עם מודל עכבר לאצי וassay המוטציה לאצי, החלטנו להמשיך את המערכת הזו עוד יותר לניתוח mutagenesis בגזע hematopoietic ואוכלוסיות אב.

רקמות hematopoietic היא מאופיינות היטב במונחים של הפנוטיפ של הרכיבים הבודדים שלה, כוללים בתאי גזע repopulating לטווח ארוך, אשר ניתנים לזיהוי כאוכלוסייה נדירה ביותר של לין פני תא ^– IL7R <sup> – SCA-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– תאי ^29. . Mohrin אח' ⁴ הראו כי האוכלוסייה הגדולה במעט של LSK/Flk2 ^– תאים הם עדיין נציגים טובים לHSCs ושונה באופן משמעותי מהאב מיאלואידית מחויב הפרימיטיבי ביותר אוכלוסייה (CMP) כשזה מגיע ללימוד תיקון DNA. יתר על כן, כאשר LSK המועשר-HSC (flk-2 ⁺ וflk-2 ^-) תאים הושוו ללין ^– IL7R ^– SCA-1-cKit ^{+ +} (תאי אב LS-K), יש עדיין היה הבדל משמעותי ב יכולת NHEJ ⁵ בין פחות טהור, גזע אוכלוסיית LSK המועשר בתאים ותאי האב. במחקר שלנו אנו משתמשים HSC מועשר LSK (flk-2 ⁺ וflk-2 ^-) תאים כי מצאנו כי לפחות 2 x 10 ⁵ תאים נדרשים לתוצאות עקביות, אמינות בassay mutagenesis זה; מספר תא זה קשה מאודלהשיג כאשר אחד ממיין את LSK/Flk2 ^– אוכלוסיית CD150 ⁺ CD48 או אפילו LSK/Flk2 ^– האוכלוסייה (במונחים של עכברים, עלויות ומעשיות). פרוטוקול זה, המבוסס על אחד שפותח במקור על ידי קולר et al. ¹⁸ מתאר בפירוט כיצד תדירות המוטציה הספונטנית DNA ניתן לקבוע בתאי LSK והוגדרה אוכלוסיות של תאי מיאלואידית מובחנים, כמו גם תאי מח עצם unseparated וטחול.