تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

في معظم أنسجة وخلايا متباينة لديها محدودة مدى الحياة. للحفاظ على سلامة وظيفية، والخلايا الجذعية الأنسجة محددة الأجل الطويل تنتج باستمرار الخلايا الاصلية التي تعطي بدورها إلى ظهور خلايا متباينة تماما المطلوب للوظيفة أن الأنسجة معينة. الخلايا الجذعية أيضا تجديد المقصورة الخاصة بهم من خلال عملية تسمى التجديد الذاتي. وبالتالي، والخلايا الجذعية هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة وظيفية من الأنسجة التي يقيمون فيها ولذلك، لا بد من أن أنها مجهزة آليات قوية لاستشعار ويحتمل أن إصلاح تلف الحمض النووي. إذا لم يكن كذلك، قد يكتسب متعددة الجيني (يمكن أن تكون ضارة) الاضطرابات، والتي يمكن أن تكون موروثة من قبل ذريتها. فهم كيفية الخلايا الجذعية آمن حراسة الجينوم أثناء العمر الافتراضي للكائن الحي هو السؤال المهم، وربما تساعدنا على فهم لماذا يرتبط عدم الاستقرار الجيني مع السرطان وبعض الأمراض المرتبطة بالعمر أخرى (إعادة النظر في ^1،2).

<p clالحمار = "jove_content"> السيطرة على سلامة الجينوم من الأنسجة على مستوى الخلايا الجذعية أو السكان الخلية السلف في وقت مبكر يمكن أن يتحقق إما عن طريق القضاء على عيب الجذعية (أو السلف) الخلايا عبر موت الخلية، الشيخوخة أو التمايز، و / أو عن طريق إصلاح كفاءة الحمض النووي للتلف. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أنه من الممكن لقياس أنواع معينة من إصلاح الحمض النووي مباشرة في هؤلاء السكان نادرة ^3-6. تم العثور على أنه، على سبيل المثال في نظام المكونة للدم، فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة يمكن إصلاحه من قبل إعادة التركيب مثلي (HR) أو نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ)، ويجري هذا الأخير عملية إصلاح الدنيا الإخلاص، وبالتالي زيادة خطر اتخاذ أخطاء. وتستخدم في كل من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ^4،5، ولكن في الفئران يبدو أنها في الغالب NHEJ في HSCs في حين أن الخلايا الأسلاف في وقت مبكر الاستفادة من الموارد البشرية ^4. وقدم ملاحظة مماثلة للخلايا الجذعية في الجلد ^6. ومن المثير للاهتمام، في الإنسان HSCs الموارد البشرية، لا NHEJ،ويبدو أن آلية إصلاح خيار لفواصل حبلا مزدوجة ^3. إذا كان هذا الفرق الوظيفي بين النوعين هو حقيقي أو يمثل الفرق تكنولوجية أو مجرد التجريبية يبقى أن نرى.

مرجع خلية الجذعية لإصلاح تلف الحمض النووي من المرجح أن تشمل آليات إصلاح الحمض النووي الأخرى، مثل إصلاح قاعدة الختان (ديسمبر)، النوكليوتيدات إصلاح الختان (NER) وإصلاح عدم تطابق (MMR). البر وNER هي المسؤولة عن إصلاح الآفات الزوج قاعدة واحدة أو متعددة في الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل، في حين عدم التطابق إصلاحات MMR قاعدة قاعدة والحلقات الإدراج / حذف؛ هذه الأنواع من الحمض النووي من التلف لا يمكن إصلاحه من قبل NHEJ أو الموارد البشرية. دعم هذه الفكرة العديد من الدراسات من نظام المكونة للدم مما يدل على وجود صلة بين التعديلات في واحدة من هذه الممرات وتشوهات في المقصورة HSC ^7-9، فضلا عن زيادة خطر تطور متلازمة خلل التنسج النقوي ^10-16، وهو المرض الذي ينشأ فيويرتبط شهادة الثانوية العامة وذلك مع زيادة عدم الاستقرار الجيني كما تقدم المرض ^17. اعتبارا من بعد، لم يتم الإبلاغ عن قياسات البر، نير وMMR مباشرة في HSCs.

بالإضافة إلى توضيح العمليات المختلفة التي تتحكم في سلامة الأنسجة على مستوى الآلية، لا بد أن تكون قادرة على قياس مدى تحور الحمض النووي، بحيث يمكن اختبار عواقب الانحرافات في واحدة من هذه العمليات، على سبيل المثال في الحالات العادية مقابل راثيا الخلايا الجذعية هندسيا أو القديمة مقابل الشباب. ومع ذلك، وضع مقايسة ذات الصلة من الصعب بسبب ندرة الخلايا الجذعية الأنسجة محددة وعدم وجود ظروف الثقافة التي تحافظ على "stemness". علاوة على ذلك، ينبغي أن يكون مثل هذا الفحص قابلة للتعديل إلى التلاعب البيئية والوراثية. أحد الحلول الممكنة لهذه القيود والمتطلبات هو استخدام نماذج الماوس التي صممت خصيصا للكشف عن الطفرات الحمض النووي.

مولوقد وضعت نماذج الماوس المعدلة وراثيا tiple للكشف عن الطفرات. على سبيل المثال، اسي الفئران المعدلة وراثيا ¹⁸ تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي الجين يشفر اسي القامع للمشغل لاك وبمثابة مراسل الطفرة. على تحور الجين اسي، يتم تنشيط المشغل لاك ويتم إنتاج β-غالاكتوزيداز. يشق β-غالاكتوزيداز ومولد اللون الركيزة X-غال (5-برومو-4-كلورو الإلكترونية indolyl-β-D-galactopyranoside)، الذي يحوله الأزرق. مواقع كوس المرافقة ناقلات اسي يسمح الانتعاش سهلة من خلال امدا البروتينات فج والعدوى اللاحقة من E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة X-غال، يمكن وسجل لويحات. ويحات زرقاء تحتوي على متحولة المفترضة لاك-I تحمل فج، في حين لويحات واضحة تؤوي غير المسوخ. تردد لويحات زرقاء (من بين اله منها واضح) يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. وعلاوة على ذلك، فإن فج λ استضافة هدف اسي يمكن أن تكون متسلسلة بسهولة باستخدام تقنيات PCR للتحليل إنتاجية عالية نسبيا. وسوف تتابع متعددة الجينات الطافرة اسي تكشف عن معلومات مهمة حول الطيف الطفرة، والتي بدورها قد تشير إلى أوجه القصور المحتملة في مسارات محددة إصلاح الحمض النووي أو الأحداث سمية جينية محددة. تم توحيد نظام المعدلة وراثيا اسي عبر مختبرات متعددة ¹⁹ وتتوفر الكواشف تجاريا. واحد العيب الرئيسي لنظام اسي هي قدرة محدودة للكشف عن عمليات الحذف كبيرة أو إعادة ترتيب، وبالتالي، وأساليب أخرى، على سبيل المثال متعددة الألوان FISH على هوامش الطورية حاجة لاستخدامها لتكمل هذا النقص.

داخل ناقلات λ فج من طراز اسي الماوس، هناك الجين أصغر بكثير، CII، وهي متاحة للتحليل الطفرة. حجمها، وحقيقة أن المسوخ يمكن اختيار يجعل هذا أقل كثيفة العمالة وأرخص مقايسة ²⁰ من تحليل الجينات اسي. ومع ذلك، يتم دراسة هذا الجين اسي أكثر على نطاق واسع ^ل21 الطفرات وحساسية الجينات إلى حدوث طفرات اتسم جيدا حتى لا يكون هناك فهم واضح من مخلفات الأحماض الأمينية التي تولد استجابة المظهري على ركيزة مولد اللون ^22-25.

وتشمل نماذج الماوس الأخرى للكشف عن طفرة استخدام ΦX174 أو الجينات المحورة LacZ. نموذج الفأر وراثيا ΦX174، مع A الأصلي: T → G: C طفرة الارتداد مقايسة ²⁶ أو الطفرة مقايسة ²⁷ قدما التي تسمح الكشف عن مجموعة متنوعة من بدائل الزوج القاعدة، يمثل النظام أقل تكلفة من طراز اسي. ومع ذلك، فإن شاشة طفرية في مقايسة إلى الأمام ليست تافهة والمواصفات الطفرةليس كما يتميز جيدا trum من التحوير ΦX174 كما ان من اسي. في نماذج الماوس تحمل الجينات المحورة LacZ، يتم استرداد مراسل طفرية LacZ الاستفادة E. الخلايا المضيفة القولونية التي تعتبر حساسة لالجالاكتوز والمتوسطة التي تحتوي على اللبن ^28. ومن عيوب هذا النظام هو أن انتعاش الهدف LacZ ينطوي أيضا على تقييد نوكلياز داخلية الهضم تليها ربط و electroporation من E. تستضيف القولونية، مما يجعل من الصعب على التكيف مع النظام لأعداد صغيرة من الخلايا. على الرغم من أنه ليس شرطا مطلقا للعمل مع السكان الخلايا الجذعية / السلف (واحد يمكن أن تبدأ دائما مع مزيد من الفئران)، إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من الخلايا (مثل الملايين أو أكثر) وسوف يصبح غير عملي بسرعة وباهظة التكلفة. أيضا، حجم كبير نسبيا من LacZ، مع توفير مراسل طفرية حساسة، هي مرهقة ومكلفة أكثر للتحليل تسلسل الحمض النووي وdetermination من طفرة الأطياف. والميزة الرئيسية لهذا النموذج ومع ذلك، هو قدرتها على الكشف عن الحذف والإدراج كبيرة، فضلا عن إعادة ترتيب الكروموسومات.

حيث أن جميع الخلايا في نماذج الماوس المعدلة وراثيا اسي، ΦX174 وLacZ تحمل نظام المراسل، أي من هذه النماذج الماوس يمكن استخدامها لقياس الطفرات في أي نوع من الخلايا في المصالح، بما في ذلك الخلايا الجذعية والسلف، طالما أنها يمكن أن تحصد موثوق وبأعداد كافية. لأن كان لدينا خبرة واسعة مع نموذج الفأر اسي واسي فحص الطفرة، قررنا متابعة هذا النظام لتحليل مزيد من الطفرات في الجذعية المكونة للدم والسكان السلف.

الأنسجة المكونة للدم يتميز جيدا من حيث النمط الظاهري سطح الخلية مكوناته الفردية، بما في ذلك إعادة إسكانها الخلايا الجذعية طويلة الأجل، والتي يمكن تحديدها على النحو السكان نادرة للغاية من لين ^– IL7R <suع> – هيئة السلع التموينية-1 ^{+ + +} cKit (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– الخلايا ^29. . Mohrin ⁴ آخرون أظهرت أن عدد السكان أكبر قليلا من LSK/Flk2 ^– خلايا لا تزال جيدة لممثلي HSCs وتختلف اختلافا كبيرا من الأكثر بدائية السلف النخاعي ملتزمة (CMP) السكان عندما يتعلق الأمر بدراسة إصلاح الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، عندما LSK HSC المخصب (FLK-2 ⁺ وFLK-2 ^-) وتمت مقارنة الخلايا إلى لين ^– IL7R ^– هيئة السلع التموينية-1-cKit ^{+ +} (الخلايا الاصلية LS-K)، وكان لا يزال هناك اختلاف كبير في NHEJ قدرة ⁵ بين أقل نقية، وقف التخصيب خلية السكان LSK والخلايا الاصلية. في دراستنا نستخدم HSC التخصيب LSK (FLK-2 ⁺ وFLK-2 ^-) خلايا لأننا وجدنا أن لا يقل عن 2 × 10 ⁵ خلايا مطلوبة ل، نتائج متسقة يمكن الاعتماد عليها في هذا الطفرات فحص، وهذا هو عدد الخلايا في غاية الصعوبةللحصول على واحدة عند فرز LSK/Flk2 ^– السكان CD150 ⁺ CD48 أو حتى LSK/Flk2 ^– السكان (من حيث الفئران والتكاليف والتطبيق العملي). هذا البروتوكول، على أساس واحد ضعت أصلا من قبل كولر وآخرون ¹⁸ يصف بالتفصيل كيف يمكن تحديد عفوية تردد متحولة الحمض النووي في الخلايا LSK والسكان من خلايا الدم النخاعي متباينة وكذلك خلايا نخاع العظم والطحال unseparated محددة.