Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Çok dokusunda, farklılaşmış hücreler sınırlı bir yaşam süresi vardır. Fonksiyonel bütünlüğünü korumak için, uzun ömürlü, dokuya özel kök hücreler sürekli olarak da söz konusu doku işlevi için gerekli olan tam olarak farklılaşmış hücrelere neden progenitör hücreler üretir. Kök hücreler aynı zamanda kendini yenileme olarak adlandırılan bir süreçte kendi bölmesini doldurmak. Böylece, kök hücreler nedenle içeri ikamet dokusunun fonksiyonel bütünlüğünün korunmasından sorumlu olan, bunların hasarlı DNA'yı duygusu ve potansiyel onarmak için sağlam mekanizmalar ile donatılmış olması zorunludur. Değilse, onların soyu ile kalıtsal olabilir çoklu genomik (zararlı) tedirginlikler, edinebilirler. Kök hücreler bir organizmanın ömrü boyunca kendi genomunu güvenli-guard nasıl anlamak önemli bir sorudur ve genomik istikrarsızlık kanser ve ^(1,2 gözden) diğer bazı yaşa bağlı hastalıklar ile bağlantılı neden anlamamıza yardımcı olabilir.

<p class = "jove_content"> kök hücre veya erken projenitör hücre popülasyonlarının düzeyinde bir doku genomik bütünlüğünü kontrol / hücre ölümü, yaşlanma ya da farklılaşma ile kök hücrelerinin kusurlu (veya progenitör) ortadan kaldırılması, ve her iki tarafından ya da etkili bir tamir ile elde edilebilir hasarlı DNA. Son çalışmalar, bu nadir popülasyonlarda ^3-6 doğrudan DNA onarımı belirli türde ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir. Bu, örneğin, hematopoietik sistem içinde, çift iplikli DNA sonları (NHEJ), ikincisi daha düşük aslına uygunluk onarım işlemi olmak ve böylece yapma riski birleştirme, homolog rekombinasyon (HR) ya da homolog olmayan sonunda tamir edilebilir olduğu bulunmuştur hataları. Hem hematopoetik kök hücre (HSC) ^4,5 olarak kullanılmaktadır, ancak, farelerde erken ataları hücrelerin HR ⁴ kullanmak ise o HKH'lerin ağırlıklı NHEJ görünüyor. Benzer bir gözlem cilt ⁶ kök hücreleri için yapıldı. İlginç bir şekilde, insan HSC İK değil, NHEJ,çift ​​iplikli sonları ³ için tercih tamir mekanizması gibi görünüyor. İki tür arasındaki bu işlevsel fark gerçek ya da sadece bir teknolojik ya da deneysel farkı temsil olsun görülecektir.

Hasarlı DNA tamir Bir kök hücrenin repertuarı, baz eksizyon tamiri (BER), nükleotid eksizyon tamir (NER) ve uyumsuzluğu onarım (MMR) gibi diğer DNA onarım mekanizmaları dahil etmek olasıdır. DNA hasarı bu tür NHEJ veya İK tarafından tamir edilemez; MMR düzeltmeleri baz baz uyumsuzlukları ve ekleme / silme while döngüleri BER ve NER, tek sarmallı DNA tek veya birden fazla baz çifti lezyonların tamiri için sorumludur. Bu kavramı desteklemek HSC bölme ^7-9, bu yolların ve anormalliklerin birinde değişiklikler arasında bir bağlantı gösteren hematopoietik sistemi yanı sıra, miyelodisplastik sendrom ^10-16 kaynaklanan bir hastalığa yakalanma riski birçok çalışmalarHSC ve hastalık ilerledikçe ¹⁷ genomik instabilite artan ile ilişkilidir. Henüz itibariyle, doğrudan HKH'lerin BER, NER ve MMR ölçümleri rapor edilmemiştir.

Mekanik bir düzeyde doku bütünlüğünü kontrol çeşitli işlemleri açıklık ek olarak, bu işlemlerin biri sapmalarını sonuçları genetik karşı, normal olarak, örneğin, test edilebilir, böylece mutasyona uğramış DNA seviyesini ölçmek mümkün zorunludur mühendislik kök hücreleri veya genç, karşı eski içinde. Bununla birlikte, ilgili bir tahlilin geliştirilmesi için dokuya özel kök hücrelerin yetersizliği ve "stemness" korur kültür koşulları eksikliği zordur. Ayrıca, bu tür bir deney Çevresel ve genetik manipülasyonlara iyileştirilebilir olmalıdır. Bu sınırlamalar ve gereksinimlerine Muhtemel bir çözüm, özellikle DNA mutasyonları tespit etmek için tasarlanmıştır fare modelleri kullanılmasıdır.

Mulmutasyon tespiti için tiplemesine transgenik fare modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, transgenik fareler, LacI ¹⁸ LacI gen Lac operatörün bastırıcı kodlayan ve mutasyon muhabir olarak hizmet ettiği LacI raportör sistemi kodlayan bir geri kazanılabilir λ faj vektörü taşır. LacI geninin mutasyon üzerine, Lac operatör etkinleştirilir ve β-galaktosidaz üretilir. β-galaktosidaz böler mavi döner kromojenik alt-tabaka X-gal (5-bromo-4-kloro-e-indolil-β-D-galaktopiranosid). LacI vektörü yan cos siteleri lambda faj protein ve E, daha sonraki enfeksiyonlar ile kolayca giderilmesini sağlar coli. E. inkübe edildikten sonra, enfekte coli X-gal alt tabakayı içeren agaroz, plaklar attı olabilir. Net plaklar olmayan mutantlar liman iken mavi plaklar, Lac-I fajının taşıyan bir farazi mutant içerir. Inci arasında mavi plakların frekansı (e açık olanlar) DNA ekstre edilmiş orijinal hücre popülasyonunda mutant frekansı gösterir. Ayrıca, LacI hedef barındıran λ fajlar, nispeten yüksek verimli analizi için PCR teknikleri kullanılarak dizilenebilir. Birden mutant LacI genleri Dizmek da spesifik DNA onarım yollarındaki olası eksiklikler veya belirli genotoksik olaylara işaret edebilir mutasyon spektrumu hakkında önemli bilgiler ortaya koyacaktır. LacI transgenik sistemi, çok sayıda laboratuarlar ¹⁹ standartlaştırıldı ve ayıraçlar piyasada mevcuttur. LacI sistemin bir dezavantajı, büyük silinti ve yeniden düzenlemeleri tespit etmek için sınırlı bir yeteneği vardır, bu nedenle, metafaz yayılır diğer yöntemler, örneğin çok renkli FISH bu eksikliği iltifat için kullanılması gerekmektedir.

LacI fare modeli λ faj vektörü içinde, çok daha küçük bir gen, CII orada, Mutasyon analizi için kullanılabilir. Boyutu ve mutantlar seçilebilir olması bu LacI gen analizi daha az emek-yoğun ve daha ucuz deney ²⁰ hale getirir. Bir kromojenik alt tabaka ^22-25 bir fenotipik yanıt oluşturmak amino asit kalıntılarının bir anlaşılması olduğu Bununla birlikte, LacI gen daha kapsamlı mutagenez ²¹ ve mutasyon genin hassasiyeti için çalışılmıştır, iyi karakterize edilmiştir.

Mutasyon tespiti için diğer fare modelleri ΦX174 ya da LacZ transgenlerin kullanımı bulunmaktadır. T → G: Orijinal A ΦX174 transgenik fare modeli, C reversiyon mutasyon deneyi ²⁶ veya baz çifti değiştirmelerin bir spektrum algılama, LacI modele göre daha az maliyetli bir sistem temsil verir ileri mutasyon deneyi ^27. Bununla birlikte, ön deneyde mutasyon ekran önemsiz ve mutasyon spec değilΦX174 transgen TRUM olarak LacI bu kadar iyi karakterize değildir. LacZ transgenini taşıyan fare modellerinde, LacZ raportör mutasyon E. kullanılarak elde edilir galaktoz ve ²⁸ galaktoz içeren ortama duyarlı olan coli konakçı hücreler. Bu sistemin bir dezavantajı, LacZ hedefin iyileşme de E. ligasyonu ve elektroporasyon takiben sınırlandırma endonükleaz sindirim içerir olmasıdır coli böylece zor hücreleri küçük sayılar için sisteme adapte yapma, ev sahipliği yapıyor. Bu kök / progenitör hücre popülasyonları ile çalışmak için mutlak bir gerekliliktir (bir zaman daha fareler ile başlayabilir) olmamasına rağmen hücreleri çok sayıda (örneğin, milyonlarca ya da daha fazla) gerekiyorsa, hızlı pratik ve maliyet engelleyici olacaktır. Hassas bir mutasyon muhabir sağlarken, aynı zamanda, LacZ nispeten büyük boyutlu, hantal ve DNA sekans analizi ve unsurlar için daha maliyetlidirmutasyon spektrumları ination. Bu modelin önemli bir avantajı ise, geniş eksiltmeler ve ilaveler tespit etme yeteneği, hem de kromozomal yeniden düzenlemeleri olan.

LacI, ΦX174 ve LacZ transgenik fare modellerinde tüm hücreler raportör sistemi taşımak için, bu fare modellerinin herhangi biri gibi uzun süre güvenilir bir şekilde hasat edilebilir, kök ve projenitör hücreleri dahil olmak üzere, ilgi konusu her bir hücre tipinde mutagenez ölçmek için kullanılabilir ve yeterli sayıda. Biz LacI fare modeli ve LacI mutasyon deneyi ile geniş bir deneyim oldu çünkü, biz hematopoetik kök ve progenitör toplumlarda mutagenez analizi için bu sistemi daha sürdürmeye karar verdi.

Hematopoetik doku Lin derece nadir nüfus olarak tanımlanabilir olan uzun vadeli repopulating kök hücreleri de dahil olmak üzere bireysel bileşenler, hücre yüzeyi fenotip açısından iyi karakterize olduğunu ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK'ya) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– hücreleri ^29. . DNA onarım eğitim söz konusu olduğunda hücreler hala HKH'lerin için iyi temsilcileri olan ve en ilkel taahhüt miyeloid progenitör (CMP) nüfus önemli derecede farklı ^– Mohrin ark ⁴ LSK/Flk2 biraz daha büyük nüfus olduğunu göstermiştir. Ayrıca, zaman HSC bakımından zenginleştirilmiş LSK (Flk-2 ⁺ ve Flk-2 ^{-) –} IL7R ^– hücreler, Lin karşılaştırıldı Sca-1-cKit ^{+ +} (LS-K progenitor hücreler), önemli bir fark yine yoktu az saf arasında NHEJ yeteneği ^5, hücre ile zenginleştirilmiş LSK'ya nüfusu ve progenitör kök hücreler. Bu hücre sayısı son derece zordur, en az 2 x 10 ⁵ hücre Bu mutagenez deneyde, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olduğu bulunmuştur, çünkü hücreler, ^– Çalışmamızda LSK (Flk-2 ⁺ ve Flk-2) HSC zenginleştirilmiş kullanımıCD150 ⁺ CD48 nüfus hatta LSK/Flk2 ^{– -,} nüfus (fareler, maliyet ve pratiklik açısından) bir LSK/Flk2 sıralar zaman elde edilmiştir. Başlangıçta Kohler ve ark. ¹⁸ tarafından geliştirilen birine dayalı bu protokol, spontan DNA mutant frekans farklılaşmış miyeloid hücrelerin popülasyonları gibi ayrışmamış kemik iliği ve dalak hücreleri LSK'ya hücrelerinde tespit ve tanımlanabilir nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.