Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica
Summary
En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.
Abstract
Uno de los intereses fundamentales de la neurociencia es entender la integración de entradas excitadoras e inhibidoras a lo largo de la muy compleja estructura del árbol dendrítico, que finalmente conduce a la producción neuronal de potenciales de acción en el axón. La influencia de diversos parámetros espaciales y temporales de entrada sináptica específica en la salida neuronal está actualmente bajo investigación, por ejemplo, la atenuación dependiente de la distancia de las entradas dendríticas, la interacción dependiente de la ubicación de las entradas espacialmente segregadas, la influencia de la inhibición GABAergig en la integración excitatorio, lineal y modos de integración no lineales, y muchos más.
Con micro-iontoforesis rápido de glutamato y GABA es posible investigar con precisión la integración espacial y temporal de la excitación glutamatérgica y la inhibición GABAérgica. Requisitos técnicos críticos son o bien una lámpara fluorescente activado, el diodo emisor de luz (LED), o una de dos fotones scanning microscopio para visualizar ramas dendríticas sin introducir significativa foto-daño del tejido. Además, es muy importante tener un amplificador de micro-iontoforesis que permite la compensación de capacitancia rápido de pipetas de alta resistencia. Otro punto crucial es que ningún transmisor se libera involuntariamente por la pipeta durante el experimento.
Una vez establecida, esta técnica dará señales fiables y reproducibles con una alta especificidad y neurotransmisor ubicación. En comparación con el glutamato y GABA uncaging, iontoforesis rápido permite el uso de dos transmisores en el mismo tiempo pero en lugares muy distantes sin limitación para el campo de visión. También hay ventajas en comparación con la estimulación eléctrica focal de axones: con micro-iontoforesis se conoce definitivamente la ubicación del sitio de entrada y es seguro de que sólo se libera el neurotransmisor de interés. Sin embargo, tiene que tener en cuenta que sólo con micro-iontoforesis lapostsynapse se activa y aspectos presináptica de la liberación de neurotransmisores que no se resuelven. En este artículo se demuestra cómo crear micro-iontoforesis en experimentos de cortes de cerebro.
Introduction
Las neuronas en el sistema nervioso central reciben una variedad de entradas sinápticas en sus procesos dendríticos delgadas y ramificadas 1. Allí, la mayoría de las entradas excitadoras dendríticas están mediadas por las sinapsis glutamatérgicas. Estas sinapsis se pueden activar de una manera distribuida en el espacio, lo que resulta en la integración lineal postsináptica de los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP). Si las sinapsis se activan de forma simultánea y en proximidad espacial en la dendrita, estas entradas excitadoras pueden ser integrados supra-linealmente y generan picos dendríticas 2-5.
Además, la integración de entradas excitadoras depende de la ubicación de la entrada en el árbol dendrítico. Las señales que llegan a la región distal del mechón son mucho más atenuado que las entradas proximal por filtrado de cable 6. En el hipocampo, las entradas distantes a las dendritas apicales penacho se generan por una región del cerebro diferente que los de proximal dendriTES 7. Una cuestión interesante es por lo tanto, la forma de entrada sináptica es procesada por diferentes compartimentos dendríticas y si la integración dendríticas regula la influencia de estas entradas en capas sobre el disparo neuronal de diferentes maneras.
No sólo las propiedades funcionales, las características morfológicas de la dendrita, la ubicación y la agrupación de las entradas están afectando a la integración dendríticas de entradas excitadoras, también las entradas inhibidoras adicionales de terminales GABAérgicas crucial determinar la eficacia de las sinapsis glutamatérgicas 8,9. Estos diferentes aspectos de la integración sináptica pueden ser investigados utilizando idealmente neurotransmisor micro-iontoforesis, que permite la aplicación espacialmente definida de diferentes neurotransmisores a los dominios dendríticas. Estamos aquí demostrar la forma de establecer con éxito micro-iontoforesis de glutamato y GABA para investigar la integración de señales en las neuronas.
Para esta aplicación, de punta finase utilizan pipetas de alta resistencia llenos de soluciones concentradas de neurotransmisores. Estas pipetas están posicionados cerca de la membrana externa de la célula, donde se encuentran los receptores de los neurotransmisores. Es necesaria una buena visualización de las ramas dendríticas. Esto se logra mejor mediante tintes fluorescentes, que se introducen a través de la pipeta parche. A continuación, un impulso de corriente muy corto (<1 ms) (en el rango de 10 a 100 nA) se utiliza para expulsar las moléculas neurotransmisoras cargadas. Con estos pulsos cortos y compensación de capacitancia efectiva, potenciales o corrientes postsinápticas pueden ser evocados con alta precisión temporal y espacial, lo que significa que se conoce con precisión la ubicación de la entrada excitadora. El glutamato micro-iontoforesis puede activar sinapsis en un radio definido, que es menor que 6 m como se muestra aquí (Figura 1 9), pero también es posible llegar a resolución sinapsis única 10-12.
Heine, M., y col </em> mostró que la resolución espacial de las micro-iontoforesis rápido, incluso se puede ajustar para detectar tamaños por debajo de 0,5 micras, que es más pequeño que tamaños de los puntos alcanzados regularmente con uncaging de dos fotones de glutamato 13. Con micro-iontoforesis rápido que es fácilmente posible usar dos o más pipetas iontoforéticos y colocarlos en diferentes lugares, aunque distantes en el árbol dendrítico. De esta manera, la integración de eventos excitatorios, incluidos los de las diferentes vías, se puede investigar. También es posible utilizar un glutamato y una pipeta iontoforético lleno de GABA en el mismo tiempo. De esta manera el efecto de la inhibición GABAérgica en diferentes ubicaciones relativas a la entrada de excitación (en-camino, la inhibición de fuera de ruta) puede ser estudiada. Además, el impacto de la inhibición por interneuronas dirigidos dominios neuronales específicas, como las dendritas distales, soma o axones 14, puede ser investigada utilizando iontoforesis GABA. En las neuronas cultivadas, micro-iontoforesis rápido ofrece la oportunidad de investigate distribución de sinapsis individuales y los aspectos elementales de la comunicación sináptica en las neuronas de muchos más detalles 10,11.
En este artículo se demuestra en detalle la forma de establecer la iontoforesis glutamato y GABA para el uso en rodajas de cerebro de agudos, lo que permite que investigan la integración sináptica de entradas excitadoras e inhibidoras en dependencia de la ubicación de entrada, los puntos fuertes de entrada, y el momento, solo o en interacción. Vamos a señalar las ventajas y limitaciones de esta técnica y cómo solucionar con éxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí le explicamos cómo aplicar micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores para investigar la integración sináptica en las dendritas. Esta técnica se ha utilizado con éxito para investigar la transmisión sináptica glutamatérgica y GABAérgica en diferentes regiones del cerebro in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-iontoforesis se ha utilizado durante más de 60 años, pero en los primeros años, se utiliza sobre todo para bien aplicar localmente neurotransmisores y fármacos en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Hans Reiner pólder, Martin Fuhrmann y Walker Jackson para leer detenidamente el manuscrito. Los autores recibieron financiación que fue proporcionada por el Ministerio de Investigación MIWF del estado de Renania del Norte-Westfalia (SR), el BMBF-Projekträger DLR colaboración entre Estados Unidos y Alemania en neurociencia computacional (CRCNS, SR), Centros de Excelencia en Enfermedades Neurodegenerativas (COEN; SR), y la Universidad del programa de financiación habitual Bonn (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
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