سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك
Summary
في هذه المقالة ونحن نقدم سريع الصغرى الرحلان الشاردي من الناقلات العصبية كأسلوب للتحقيق التكامل من إشارات بعد المشبكي مع عالية الدقة المكانية والزمانية.
Abstract
واحدة من الاهتمامات الأساسية في علم الأعصاب هو فهم التكامل من المدخلات مثير والمثبطة على طول بنية معقدة جدا من شجرة شجيري، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى إنتاج الخلايا العصبية من إمكانات العمل في محور عصبي. تأثير العوامل المكانية والزمانية متنوعة من المدخلات متشابك محددة بشأن الانتاج العصبية هي حاليا قيد التحقيق، على سبيل المثال التوهين التي تعتمد على المسافة من المدخلات شجيري، والتفاعل الموقع التي تعتمد على مدخلات من مكانيا منفصلة، وتأثير GABAergig تثبيط على التكامل مثير، وخطي وسائط التكامل غير الخطية، وغيرها الكثير.
مع السرعة في الدقيقة الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA فمن الممكن للتحقيق بدقة التكامل المكاني والزماني للإثارة وتثبيط مستقبلات GABAergic. المتطلبات الفنية الحرجة هي إما مصباح الفلورسنت أثار، ديود باعث للضوء (LED)، أو هيئة السلع التموينية اثنين من الفوتونnning المجهر لتصور فروع شجيري دون إدخال هامة الصور ضرر في الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فمن المهم جدا أن يكون مكبر للصوت الرحلان الشاردي الصغيرة التي تسمح للحصول على تعويض السعة بسرعة من ماصات مقاومة عالية. نقطة أخرى مهمة هي أن لا الارسال يتم تحريرها كرها بواسطة ماصة أثناء التجربة.
وبمجرد إنشاء، وهذه تقنية تعطي إشارات موثوقة وقابلة للتكرار مع ناقل عصبي عالية وخصوصية المكان. مقارنة الغلوتامات وGABA uncaging، الرحلان الشاردي سريع يسمح باستخدام كل أجهزة الإرسال في نفس الوقت ولكن في أماكن بعيدة جدا دون تحديد لمجال الرؤية. وهناك أيضا مزايا مقارنة التحفيز الكهربائي التنسيق من المحاور: مع الدقيقة الرحلان الشاردي الموقع من موقع الإدخال هو معروف بالتأكيد، وأنه على يقين من أن فقط الناقل العصبي من الفائدة يتم تحريرها. ومع ذلك فإنه لابد من النظر أنه مع الدقيقة الرحلان الشاردي فقطيتم تنشيط وpostsynapse لم يتم حل الجوانب قبل المشبكي من الافراج عن العصبي. في هذه المقالة ونحن لشرح كيفية إعداد الصغرى الرحلان الشاردي في التجارب شريحة الدماغ.
Introduction
الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الحصول على مجموعة متنوعة من المدخلات متشابك على عملياتها شجيري رقيقة ومتشعبة 1. هناك، يتم بوساطة الغالبية العظمى من المدخلات شجيري مثير عن طريق نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاميرجي. يمكن تنشيط هذه نقاط الاشتباك العصبي بطريقة توزيعها مكانيا، مما أدى إلى التكامل الخطي بعد المشبكي من إمكانات بعد المشبكي مثير (EPSPs). إذا تم تنشيط نقاط الاشتباك العصبي في وقت واحد وعلى مقربة المكاني على التغصنات، هذه المدخلات مثير يمكن أن تكون متكاملة فوق خطيا وتوليد المسامير شجيري 2-5.
وعلاوة على ذلك، ودمج المدخلات مثير يعتمد على موقع للمدخلات على الشجرة شجيري. الإشارات التي تصل في المنطقة خصل البعيدة هي أكثر من ذلك بكثير الموهن من المدخلات الداني بسبب كابل تصفية 6. في قرن آمون، يتم إنشاء مدخلات بعيدة إلى التشعبات قمية خصل من منطقة في الدماغ تختلف عن تلك في dendri الدانيTES 7. بالتالي مسألة إثارة هو، كيف تتم معالجة المدخلات متشابك من قبل مقصورات شجيري مختلفة، وإذا تكامل شجيري ينظم تأثير هذه المدخلات الطبقات على إطلاق الخلايا العصبية بطرق مختلفة.
ليس فقط الخصائص الفنية والسمات الشكلية للالتغصنات، ومكان وتجميع المدخلات التي تؤثر على التكامل شجيري من المدخلات مثير، أيضا المدخلات المثبطة إضافية من محطات GABAergic حاسم تحديد مدى فعالية من نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاميرجي 8،9. هذه الجوانب المختلفة من التكامل متشابك يمكن التحقيق بشكل مثالي باستخدام ناقل عصبي الصغرى الرحلان الشاردي، والذي يسمح تطبيق تعريف مكانيا من الناقلات العصبية المختلفة إلى مجالات شجيري. علينا أن نظهر هنا كيفية تأسيس-الرحلان الشاردي الصغيرة من الغلوتامات وGABA بنجاح إلى تحقيق التكامل إشارة في الخلايا العصبية.
لهذا التطبيق، ودفع غرامة ذات الرؤوسوتستخدم ماصات مقاومة عالية مليئة حلول العصبي المركزة. يتم وضع هذه الماصات بالقرب من الغشاء الخارجي للخلية، حيث توجد مستقبلات الناقل العصبي. مطلوب التصور الجيد للفروع شجيري. ويتحقق ذلك باستخدام أفضل الأصباغ الفلورية، والتي يتم تقديمها من خلال ماصة التصحيح. ثم (<1 ميللي ثانية) نبض الحالية قصيرة جدا (في نطاق 10-100 غ) يستخدم لإخراج جزيئات الناقل العصبي مشحونة. مع هذه النبضات القصيرة والتعويض السعة فعالة وإمكانات بعد المشبكي أو التيارات يمكن أثار مع ارتفاع الزمانية والمكانية الدقة، مما يعني أن الدولة من المدخلات مثير هو معروف على وجه التحديد. الغلوتامات الصغرى الرحلان الشاردي يمكن تنشيط نقاط الاشتباك العصبي في دائرة نصف قطرها محدد، وهو أصغر من 6 ميكرون كما هو موضح هنا (الشكل 1 9)، ولكن من الممكن أيضا للوصول إلى قرار المشبك واحدة 10-12.
هاينه، M.، وآخرون </eوأظهرت M> أن القرار المكاني للسريع الصغرى الرحلان الشاردي حتى يمكن تعديلها على الفور أحجام أقل من 0.5 ميكرون، والتي هي أصغر من حجم بقعة يتحقق بانتظام مع uncaging اثنين من الفوتون من الغلوتامات 13. مع السرعة في الدقيقة الرحلان الشاردي فمن الممكن بسهولة لاستخدام اثنين أو أكثر الماصات iontophoretic ووضعها في اماكن مختلفة، وحتى البعيدة على الشجرة شجيري. في هذه الطريقة، وإدماج الأحداث مثير، بما في ذلك تلك من مسارات مختلفة، ويمكن التحقيق فيها. ومن الممكن أيضا استخدام الغلوتامات وGABA ماصة iontophoretic مليئة في نفس الوقت. وبهذه الطريقة يمكن دراسة تأثير تثبيط GABAergic في مواقع مختلفة نسبة إلى المدخلات مثير (على الطريق، وتثبيط خارج المسار). أيضا، وتأثير تثبيط من قبل interneurons استهداف المجالات العصبية محددة، مثل التشعبات البعيدة، سوما أو محاور 14، يمكن التحقيق باستخدام الرحلان الشاردي GABA. في الخلايا العصبية مثقف، وسرعة متناهية الصغر الرحلان الشاردي يتيح الفرصة لإنفيstigate توزيع المشبك واحد والجوانب الابتدائية الاتصالات متشابك في الخلايا العصبية في أكثر بكثير من التفصيل 10،11.
في هذه المقالة ونحن لشرح بالتفصيل كيفية تأسيس الرحلان الشاردي الغلوتامات وGABA للاستخدام في شرائح الدماغ الحاد، والذي يسمح بالتحقيق التكامل متشابك من المدخلات مثير والمثبطة في الاعتماد من الموقع المدخلات، ونقاط القوة المدخلات، وتوقيت، وحده أو في التفاعل. ونشير الى المزايا والقيود المفروضة على هذه التقنية وكيفية استكشاف بنجاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نجد تفسيرا لكيفية تطبيق سريع الصغرى الرحلان الشاردي من الناقلات العصبية للتحقيق التكامل متشابك على التشعبات. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لتحقيق الجلوتاميرجي وGABAergic انتقال متشابك في مناطق الدماغ المختلفة في المختبر والمجراة 9،20-22. وقد استخدم الصغرى …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر هانس رينر أرض مستصلحة من البحر، مارتن فورمان ووكر جاكسون لقراءة المخطوطة بعناية. تلقى الكتاب التمويل الذي تم توفيره من قبل وزارة البحث MIWF الدولة Northrhine-WESTFALIA (SR)، وBMBF-Projekträger DLR التعاون بين الولايات المتحدة والألمانية في علم الأعصاب الحسابية (CRCNS؛ SR)، مراكز التميز في أمراض الاعصاب (COEN؛ SR)، وجامعة بون برنامج تمويل جماعية (BONFOR؛ SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
