على<em> في المختبر</em> إعداد الخلايا العصبية المعوية المعزولة والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية من الماوس الكبار
Summary
نحن يبرهن على وجود بروتوكول زراعة الخلايا لدراسة مباشرة لمكونات الخلايا العصبية والدبقية في الجهاز العصبي المعوي. ويتم إعداد الخلايا العصبية / الدبقية ثقافة مختلطة coverslips على من الضفيرة العضلية المعوية من فأر بالغ توفير القدرة على فحص الخلايا العصبية الفردية وظيفة الخلايا الدبقية التي كتبها الكهربية، المناعى،<em> الخ</em>.
Abstract
الجهاز العصبي المعوي هو عبارة عن شبكة واسعة من الخلايا العصبية والدبقية يمتد على طول القناة الهضمية التي تتحكم ظيفيا حركية الجهاز الهضمي. ووصف الإجراء لعزل وثقافة يسكنها خليط من الخلايا العصبية والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية. يمكن الحفاظ على الثقافات الأولية لأكثر من 7 أيام، مع وصلات بين الخلايا العصبية النامية والدبقية. يتم تجريد قطاع العضلات الطولية مع المرفقة العضلية المعوية الضفيرة من العضلات الدائرية الكامنة وراء الدقاق الماوس أو القولون وتعرض لعملية الهضم الأنزيمية. في ظروف معقمة، والحفاظ على الخلايا العصبية والدبقية معزولة السكان داخل الكرية التالية الطرد المركزي ومطلي coverslips على. في غضون 24-48 ساعة، يحدث محوار ثمرة ويمكن التعرف على الخلايا العصبية بواسطة علامات عموم العصبية. بعد يومين في الثقافة، والخلايا العصبية معزولة إمكانات العمل النار كما لوحظ من الدراسات المشبك التصحيح. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يكون الدبقية المعوية identifالعبوات الناسفة من قبل GFAP تلطيخ. وهناك شبكة من الخلايا العصبية والدبقية في بدل وثيقة تشكل في غضون 5-7 أيام. يمكن أن الخلايا العصبية المعوية يكون بشكل فردي ودرس مباشرة باستخدام أساليب مثل المناعية، الكهربية، والتصوير الكالسيوم، وحيدة الخلية PCR. وعلاوة على ذلك، هذا الإجراء لا يمكن أن يؤديها في الحيوانات المعدلة وراثيا. هذه المنهجية هي بسيطة وغير مكلفة لأداء. وعموما، هذا البروتوكول إلى الكشف عن مكونات الجهاز العصبي المعوي بطريقة التلاعب بها بسهولة حتى نتمكن من اكتشاف أفضل وظيفة في الولايات ENS العادي والمرض.
Introduction
الجهاز العصبي المعوي (ENS) هي شبكة واسعة من الأعصاب والخلايا الدبقية التي تمتد على طول كامل من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. وENS تسيطر وظيفيا جميع جوانب الهضم، بما في ذلك التمعج، وامتصاص السوائل / إفراز، والإحساس من المحفزات، الخ (للمراجعة انظر 1). أنه يحتوي على أكثر من 500 مليون خلية عصبية، أكثر من الموجودة في الحبل الشوكي، ويحتوي على كل فئة الناقلات العصبية الموجودة في الدماغ. علاوة على ذلك، ENS هي فريدة من نوعها من حيث أنها يمكن أن تعمل بالغريزة دون مدخلات من الجهاز العصبي المركزي 2. فهم ENS أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم دورها فسيولوجية طبيعية، ولكن لفهم مشاركتها في مجموعة متنوعة من اعتلال الأعصاب الذي يمكن أن يكون خلقي (مرض هيرشسبرونغ)، المكتسب (داء شاغاس)، الثانوية لمرض دول (خزل المعدة السكري)، ومكافحة المخدرات التي يسببها (متلازمة الأمعاء الأفيونية)، أو بسبب الاصابة (العلوص بعد الجراحة) 1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا العصبية المعوية تكون إعادةservoir لعدوى فيروسية (الحماق النطاقي) 3. بسبب التشابه إلى الدماغ ومستويات مرتفعة من السيروتونين في الأمعاء، والأدوية التي تهدف إلى علاج عيوب الجهاز العصبي المركزي غالبا ما يكون لها آثار جانبية غير مرغوب فيها على ENS 2. ومن الجدير بالذكر أيضا أن العديد من اعتلالات الأعصاب مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون تظهر التغيرات الخلوية مماثلة في الخلايا العصبية المعوية طويلة قبل ظهورها في الخلايا العصبية المركزية، مما يجعل ENS نموذج الوصول إليها لدراسة المرضية لهذه الأمراض 4. لذلك، فهم شامل للENS هو ضرورة في فهم الحالات المرضية ومنع / توقع الآثار الجانبية الدوائية.
وقد تم دراسة الخلايا العصبية في ENS تقليديا في خنزير غينيا استخدام مستحضرات wholemount 5-7 أو الخلايا العصبية مثقف 8. وعلى الرغم من سهولة في والتي يمكن دراستها الخلايا العصبية في هذه الحيوانات الكبيرة، وهذا النموذج لديه الكثير من القيود بما في ذلكعدم وجود سلالات معدلة وراثيا، والافتقار إلى الكواشف محددة لهذا النوع، والتكلفة العالية المرتبطة اشتري هذه المواضيع والإسكان. تطوير نموذج الجهاز العصبي المعوي الفئران لديه ميزة فريدة من طرق مختلفة من أنظمة، مجموعة واسعة من المنهجيات الأخرى المنشأة التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تقنية زراعة الخلايا، والقدرة على توفير التحقق من صحة لنموذج خنزير غينيا .
ويتألف من ثلاثة ENS بلكسى التي تعمل على طول القناة الهضمية: والعضلية المعوية الضفيرة الخارجي (بين العضلات الطولية والدائرية) التي هي المسؤولة أساسا عن تصرفات تحوي من الأمعاء، وكذلك بلكسى تحت المخاطية والمخاطية، ( وجدت تحت وداخل الغشاء المخاطي، على التوالي) التي تسيطر إلى حد كبير امتصاص السوائل / إفراز والكشف عن المنبهات 1. يبدأ هذا الأسلوب مع العزلة من الضفيرة إعداد العضلات / العضلية المعوية طولية (LMMP) عن طريق تقشيرقبالة طبقة العضلات الخارجي من الجهاز الهضمي. هذا يخفض بشكل كبير بانخفاض بشأن قضايا التلوث التي تنشأ عندما تشارك الطبقة المخاطية في عزلة. ونتيجة لذلك، وهذه العملية هي مثالية لدراسة السيطرة العصبية في القدرة على الحركة بدلا من الإجراءات إفرازية من ENS.
الطريقة المعروضة هنا النتائج في ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية. واثنين على الأقل من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية موجودة على أساس الملاحظات الكهربية وimmunocytochemical السابقة 9. وجود الخلايا الدبقية هو مفيد للغاية، لأنها ليست سوى نوع من الخلايا الهامة للدراسة في حد ذاتها، ولكن لأنها تسهم في بقاء الخلايا العصبية المعوية 10 والحفاظ على التعبير مستقبلات الأم على سطح الخلية العصبية 11. وعلاوة على ذلك، قد نقص من الدبقية المعوي يؤدي إلى غير طبيعي الجهاز الهضمي الحالات المرضية حركية، صاغ 12 '-gliopathies العصبية'. ولذلك، فإن ثقافة ENS المقدمة هنا Results في العديد من أنواع الخلايا التي أصبحت جاهزة للتحقيق فيها.
مزايا لهذه المنهجية هي سهولة العزلة، ومتطلبات أداة غير مكلفة، وفترة زمنية قصيرة لإتقان هذه التقنية من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة. القيود المفروضة على منهجية تشمل انخفاض العائد خلية الإجمالي من وحدات تخزين الأنسجة عالية واستبعاد الخلايا العصبية ENS من بلكسى المخاطية وتحت المخاطية. وسوف يكون هذا الإجراء مفيدا للغاية للعلماء المتخصصين في الكهربية، المناعية، وحيدة الخلية PCR، والمنهجيات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحيوانات المستخدمة
وقد تم تحسين هذا البروتوكول بالنسبة السويسري الفئران ويبستر. ومع ذلك، وهذه الطريقة غير قابلة للتكيف بسهولة إلى غيرها من الثدييات الصغيرة مثل الفئران وغيرها من سلالات من الفئران. لقد أجرينا بنجاح العزلة الأولي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المعهد الوطني للصحة منح DA024009، DK046367 وT32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
