Un<em> In-vitro</em> Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto
Summary
We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.
Abstract
El sistema nervioso entérico es una vasta red de neuronas y glía que recorren la longitud del tracto gastrointestinal que funcionalmente controla la motilidad gastrointestinal. Se describe un procedimiento para el aislamiento y cultivo de una población mixta de neuronas y células gliales del plexo mientérico. Los cultivos primarios se pueden mantener durante más de 7 días, con conexiones en desarrollo entre las neuronas y la glía. La tira de músculo longitudinal con el adjunto del plexo mientérico se extrae del músculo circular subyacente del íleon o colon del ratón y se sometió a digestión enzimática. En condiciones estériles, la población de neuronas y glía aislado se conservan dentro del sedimento después de la centrifugación y se sembró en cubreobjetos. Dentro de 24 a 48 horas, neuritas se produce y las neuronas se pueden identificar por marcadores pan-neuronal. Después de dos días en cultivo, aisladas neuronas potenciales de acción del fuego como se observa en los estudios de patch clamp. Por otra parte, la glía entérico también puede ser identifdiado por tinción GFAP. Una red de neuronas y células gliales en estrecha aposición se forma dentro de 5 – 7 días. Neuronas entéricas pueden ser individualmente y estudiado directamente utilizando métodos tales como la inmunohistoquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio, y la PCR de una sola célula. Por otra parte, este procedimiento se puede realizar en animales modificados genéticamente. Esta metodología es simple de realizar y de bajo costo. En general, este protocolo expone los componentes del sistema nervioso entérico de una manera fácil de manipular por lo que podemos descubrir mejor la funcionalidad de la ENS en estados normales y de enfermedad.
Introduction
El sistema nervioso entérico (ENS) es vasta red de nervios y glía que recorre toda la longitud del tracto gastrointestinal (GI). La ENS controla funcionalmente todos los aspectos de la digestión, incluyendo el peristaltismo, la absorción / secreción de fluidos, sensación de estímulos, etc (para revisión ver 1). Contiene más de 500 millones de neuronas, más que las encontradas en la médula espinal, y contiene todas las clases neurotransmisor encontrado en el cerebro. Por otra parte, la ENS es única, ya que puede funcionar sin reflejo de entrada desde el sistema nervioso central 2. La comprensión de la ENS es crucial, no sólo para comprender su papel fisiológico normal, pero para comprender su participación en una variedad de neuropatías que pueden ser congénito (enfermedad de Hirschsprung), adquirida (enfermedad de Chagas), secundaria a estados de enfermedad (gastroparesia diabética), drogas inducida (síndrome de intestino narcótico), o debido a una lesión (íleo posoperatorio) 1. Además, las neuronas entéricas pueden ser un reSERVOIR para la infección viral (varicela zoster) 3. Debido a sus similitudes con el cerebro y los altos niveles de serotonina en el intestino, medicamentos destinados a tratar los defectos del sistema nervioso central a menudo tienen efectos secundarios no deseados en la ENS 2. También es digno de mención que muchas neuropatías tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson muestran cambios celulares similares en las neuronas entéricas mucho antes de su aparición en las neuronas centrales, por lo que la ENS un modelo accesible para estudiar la patogénesis de estas enfermedades 4. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la ENS es una necesidad en la comprensión de los estados de enfermedad y la prevención / la predicción de efectos secundarios farmacológicos.
Las neuronas de la ENS se han estudiado tradicionalmente en el conejillo de indias usando preparaciones de wholemount 5-7 o neuronas cultivadas 8. A pesar de la facilidad con la que las neuronas pueden ser estudiados en este gran animal, este modelo tiene muchas limitaciones comofalta de cepas modificadas genéticamente, la falta de reactivos específicos para esta especie, y el alto costo asociado con el pedido y albergar estos temas. El desarrollo de un modelo de sistema nervioso entérico murino tiene la ventaja única de diversos sistemas de golpe hacia fuera, una amplia gama de otras metodologías establecidas que pueden ser utilizados en conjunción con la técnica de cultivo celular, y la capacidad de proporcionar una validación para el modelo de cobaya .
La ENS se compone de tres plexi que corren a lo largo del tracto gastrointestinal: el plexo mientérico exterior (entre el músculo longitudinal y circular), que es principalmente responsable de las acciones peristálticos del intestino, así como los plexos submucosa y la mucosa, ( encontrado en y dentro de la mucosa, respectivamente), que controla en gran medida la absorción / secreción de fluido y la detección de los estímulos 1. Este método comienza con el aislamiento de la preparación del plexo muscular / mientérico longitudinal (LMMP) por peladofuera de la capa muscular exterior del tracto GI. Esto reduce drásticamente los problemas de contaminación que surgen cuando la capa de la mucosa está involucrado en el aislamiento. Como resultado, este proceso es ideal para el estudio del control neuronal de la motilidad en lugar de acciones de secreción de la ENS.
El método que aquí se presenta resultados en un cultivo mixto de las neuronas y células gliales entéricas. Al menos dos tipos diferentes de neuronas se basan presente en las anteriores observaciones electrofisiológicas y inmunocitoquímico 9. La presencia de la glía es muy ventajoso, ya que no sólo son un importante tipo de células a estudiar en su propio derecho, pero que contribuyen a la supervivencia de las neuronas entéricas 10 y mantener la expresión del receptor nativo en la superficie celular neuronal 11. Por otra parte, las deficiencias de la glía entérica pueden conducir a estados de enfermedad motilidad gastrointestinal anormal, acuñadas 12 'neuro-gliopathies. Por lo tanto, la cultura ENS presenta aquí resultados en varios tipos de células que están maduras para la investigación.
Las ventajas de este método son la facilidad de aislamiento, requerimientos de herramientas de bajo costo y muy poco tiempo para dominar la técnica por personal de laboratorio con experiencia. Limitaciones de la metodología incluyen el rendimiento general de la célula baja de volúmenes de los tejidos y la exclusión de las neuronas del plexo ENS mucosa y submucosa. Este procedimiento será muy ventajoso para los estudiosos especializados en electrofisiología, inmunohistoquímica, PCR de una sola célula, y otras metodologías.
Protocol
Representative Results
Discussion
Animals Used
This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and μ-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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