Ein<em> In-vitro</em> Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus
Summary
We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.
Abstract
Die enterale Nervensystem ist ein riesiges Netz von Neuronen und Gliazellen, die die Länge des Magen-Darm-Trakt, die funktionell steuert gastrointestinalen Motilität. Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von einer gemischten Population von Neuronen und Gliazellen aus dem Plexus myentericus beschrieben. Die primären Kulturen kann für mehr als 7 Tage gehalten werden, mit Verbindungen zwischen den Neuronen entwickeln und Gliazellen. Die Längsmuskel Streifen mit dem beigefügten myentericus Plexus aus dem zugrunde liegenden kreisförmigen Muskel der Maus Ileum oder Kolon abgestreift und einer enzymatischen Verdauung. In sterilen Bedingungen werden die isolierten neuronalen und Gliazellen Bevölkerung im Pellet nach Zentrifugation erhalten und plattiert auf Deckgläsern. Innerhalb von 24-48 Stunden, tritt Neuritenwachstum und Neuronen kann durch pan-neuronalen Marker identifiziert werden. Nach zwei Tagen in Kultur isolierten Neuronen feuern Aktionspotentiale durch Patch-Clamp-Studien beobachtet. Darüber hinaus können auch magensaftresistente Glia identif seinied von GFAP-Färbung. Ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in enger Apposition bildet innerhalb von 5 – 7 Tage die. Enteric Neuronen können individuell und direkt untersucht mit Methoden wie Immunhistochemie, Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging und Single-Cell-PCR. Darüber hinaus kann dieses Verfahren in genetisch veränderte Tiere durchgeführt werden. Diese Methode ist einfach durchzuführen und kostengünstig. Insgesamt macht dieses Protokoll die Komponenten des enteralen Nervensystems in einem leicht manipuliert Weise, so dass wir Ihnen besser entdecken Sie die Funktionalität der ENS in normalen und Krankheitszuständen.
Introduction
Das enterische Nervensystem (ENS) ist groß Netzwerk von Nerven und Gliazellen, die die gesamte Länge des Magen-Darm-Trakt (GI) verläuft. Die ENS funktionell steuert alle Aspekte der Verdauung, darunter Peristaltik, Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion, Gefühl von Stimuli, etc (für eine Übersicht siehe 1). Es enthält über 500 Millionen Nervenzellen, mehr als im Rückenmark gefunden, und enthält jede Klasse Neurotransmitter im Gehirn gefunden. Darüber hinaus ist die ENS einzigartig, dass es reflexiv funktionieren, ohne Eingabe von dem zentralen Nervensystem 2. Verständnis der ENS ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur, um seine normale physiologische Rolle zu verstehen, aber ihr Engagement in einer Vielzahl von Neuropathien, die angeboren (Morbus Hirschsprung), erworben (Chagas), sekundäre Krankheitszuständen (diabetischer Gastroparese), Drogen verstehen können induzierte (Opioid Darm-Syndrom), oder wegen der Verletzung (postoperative Ileus) 1. Darüber hinaus können enterischen Neuronen eine erneute seinservoir für virale Infektion (Varizella-Zoster) 3. Wegen seiner Ähnlichkeit mit dem Gehirn und der hohen Konzentration von Serotonin im Darm, Medikamente bei der Behandlung des zentralen Nervensystems Mängel gerichtet haben oft unerwünschte Nebenwirkungen auf das ENS 2. Bemerkenswert ist auch, dass viele Neuropathien wie Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit ähnliche zelluläre Veränderungen in den Neuronen magensaftresistente lange vor ihrem Auftritt in zentralen Neuronen zeigen, was die ENS ein zugängliches Modell, um die Pathogenese dieser Erkrankungen 4 studieren. Daher ist ein umfassendes Verständnis der ENS eine Notwendigkeit für das Verständnis Krankheitszuständen und Verhinderung / Vorhersage pharmakologischen Nebenwirkungen.
Die Neuronen des ENS wurden traditionell in der Meerschweinchen mit wholemount Vorbereitungen 5-7 oder 8 kultivierten Neuronen untersucht. Trotz der Leichtigkeit, mit der Nervenzellen in diesem großen Tier untersucht werden können, hat dieses Modell viele Einschränkungen einschließlichMangel an genetisch veränderten Stämme, Mangel an spezifischen Reagenzien zu dieser Spezies, und der hohen Kosten, die mit der Bestellung und beherbergt diese Themen verbunden. Die Entwicklung eines murinen enterale Nervensystem Modell hat den einzigartigen Vorteil der verschiedenen Knock-out-Systeme, eine breite Palette von anderen etablierten Methoden, die in Verbindung mit der Zellkultur-Technik verwendet werden können, und die Fähigkeit, eine Validierung für die Meerschweinchen-Modell bieten .
Die äußere Plexus myentericus (zwischen der Längs-und Ringmuskulatur), die hauptsächlich verantwortlich für die Peristaltik des Darms Aktionen ist, sowie die submuköse und Schleimhaut-Plexi, (: Das ENS besteht aus drei Plexi, die die Länge des Magen-Darm-Trakt führen umfasste gefunden unter und innerhalb der Schleimhaut, jeweils), die im Wesentlichen steuert Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion und Nachweis von Stimuli 1. Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung des Längsmuskel / myenteric Plexus (LMMP) Herstellung durch AbziehenAus der äußeren Muskulatur des Magen-Darm-Trakt. Diese dramatisch verkürzt sich auf Kontamination Probleme, die bei der Schleimschicht in der Isolierung beteiligt ist auftreten. Dadurch ist dieses Verfahren ideal für die Untersuchung der neuronalen Steuerung der Motilität anstatt sekretorischen Aktionen des ENS.
Die hier vorgestellte Methode Ergebnisse in einer Mischkultur von enterischen Neuronen und Gliazellen. Mindestens zwei verschiedene Arten von Neuronen sind auf vorherige elektrophysiologischen und immunozytochemische Beobachtungen 9 basiert. Die Anwesenheit von Glia ist sehr vorteilhaft, da sie nicht nur ein wichtiger Zelltyp in ihrem eigenen Recht zu studieren, aber sie tragen zum Überleben der Neuronen 10 magensaftresistente und pflegen nativen Rezeptor-Expression auf der neuronalen Zelloberfläche 11. Darüber hinaus kann Mängel magensaftresistente Glia zu abnormen gastrointestinale Motilität Krankheitszuständen, geprägt 'Neuro-gliopathies "12 führen. Daher legte die ENS Kultur hier rrgebnisse in mehreren Zelltypen, die reif für die Untersuchung sind.
Die Vorteile dieser Methode sind einfache Isolation, preiswertes Tool Anforderungen, und eine kurze Zeit, um die Technik von erfahrenen Labor-Mitarbeiter zu meistern. Einschränkungen der Methode sind insgesamt gering Zellausbeute von hoher Gewebe Volumen und den Ausschluss von ENS Neuronen aus Schleimhaut und Submukosa Plexi. Dieses Verfahren wird als sehr vorteilhaft für Wissenschaftler, spezialisiert auf Elektrophysiologie, Immunhistochemie, single-cell PCR und andere Methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Animals Used
This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and μ-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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