Quantitative<em> In vitro</em> Assay misurare Adesione neutrofili attivati per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche
Summary
L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette la<em> In vitro</em> Quantificazione di neutrofilo umana primaria legame alle cellule endoteliali attivate da mediatori infiammatori in condizioni statiche.
Abstract
L'endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria. Durante la fase acuta dell'infiammazione, cellule endoteliali (EC) sono attivati da mediatori ospitanti o direttamente da componenti microbici conservati o molecole pericolo ospite-derivati. Attivati ecs esprimere citochine, chemochine e molecole di adesione che mobilitano, attivano e mantengono leucociti nel sito di infezione o lesioni. Neutrofili sono i primi ad arrivare leucociti, e aderire alla endotelio attraverso una varietà di molecole di adesione presenti sulle superfici di entrambe le celle. Le principali funzioni di neutrofili sono eliminare direttamente minacce microbiche, promuovere l'assunzione di altri leucociti attraverso il rilascio di fattori aggiuntivi, e avviare riparazione della ferita. Pertanto, il loro reclutamento e attaccamento alla endotelio è un passaggio fondamentale nell'iniziazione della risposta infiammatoria. In questo rapporto, descriviamo un test di adesione in vitro usando neutrofilicalceina AM-etichettato neutrofili umani primari per quantificare il grado di attivazione delle cellule endoteliali microvascolari in condizioni statiche. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che gli stessi campioni quantizzati mediante spettrofotometria a fluorescenza possono anche essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per una valutazione più qualitativa di legame neutrofili.
Introduction
Poiché l'endotelio vascolare è in contatto diretto con il sangue circolante, esso è sitato ad iniziare una risposta infiammatoria rapido durante infezioni o lesioni. Le cellule endoteliali (EC) recettori di pattern recognition espresso che riconoscono una varietà di componenti batteriche conservati e molecole pericolo, e recettori per Host mediatori infiammatori, come TNFa. Attivazione di questi recettori induce EC per secernere citochine (es IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e per upregulate molecole di adesione (ad esempio E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) alla loro superficie cellulare 1 , 2. Queste molecole tutto facilitano la localizzazione dei leucociti ai siti di infezione e lesioni per chiarire l'host di agenti infettivi e avviare la riparazione tissutale 3,4. La risposta dei neutrofili all'infezione comporta un'interazione ben coordinato tra l'endotelio vascolare e la risposta neutrofili. All'attivazione EC, IL-8 è secreto e forma un gradiente intravascolare sull'endotelio che permette di neutrofili casa al sito di infezione o lesioni 5,6. E / P-selectine mediata neutrofili cattura e rotolare attraverso le associazioni relativamente deboli con glycomolecules sulla superficie cellulare dei neutrofili. Queste interazioni, insieme con IL-8 legame ai suoi recettori cognate, facilitano il robusto, attaccamento integrina-mediata ed eventuale arresto dei neutrofili sulla superficie delle cellule endoteliali 7-10. Dopo l'arresto, i neutrofili possono migrare fuori della vascolarizzazione ai siti specifici di infezione di eliminare direttamente i patogeni, generare neutrofili trappole extracellulari per prevenire la diffusione di agenti patogeni, promuovere la guarigione delle ferite e rilasciare fattori aggiuntivi che reclutano leucociti altri come monociti, macrofagi e dendritiche cellule 11-17.
Descritte nella presente relazione è un metodo in vitro per quantificare l'adesione dei neutrofili alle microVascular I CE dopo l'attivazione da parte del mediatore infiammatorio ospite TNFa. Questo test è stato progettato per valutare l'attivazione delle cellule endoteliali, e non neutrofili. Neutrofili umani primari sono stato isolato utilizzando separazione gradiente di densità, e sono quindi etichettati con calceina acetossimetil (AM). Esterasi all'interno delle cellule in diretta idrolizzano calceina AM alla molecola calceina altamente fluorescente con una eccitazione di 492-495 nm ed emissione di 513-516 nm 18. I neutrofili fluorescenza marcata vengono poi incubate con monostrati CE, e neutrofili non aderenti sono successivamente rimossi. La fluorescenza dei rimanenti, neutrofili legato viene quindi misurata mediante uno spettrofotometro a fluorescenza, e calcolata come percentuale del totale dei neutrofili ingresso fluorescenza per pozzetto. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che i neutrofili calceina-etichettati vincolati utilizzati in spettrofotometria possono essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per dare una lettura più qualitativa di ac CEtivazione. Dal momento che questo test viene eseguito in condizioni statiche, saranno valutati solo gli eventi molto iniziali che si verificano nella adesione cascata neutrofili. Ciò è confermato in questo rapporto utilizzando anticorpi bloccanti E-selectina per dimostrare che l'adesione dei neutrofili alle TNFa-trattato polmone umano microvascolare CE (HMVEC-Lung) monostrati si riduce drasticamente quando l'interazione con la E-selectina è perturbato.
Oltre a TNFa, abbiamo utilizzato con successo questo test per determinare l'entità della vena ombelicale CE attivazione umana (HUVEC) dal recettore Toll-like mezzo agonisti lipoproteine peptidoglicano-associato (PAL), murein lipoproteina (MLP) e Pam3Cys e attivazione HMVEC-Lung da Pam3Cys 19,20. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo test con inibitori delle chinasi e dopo knockdown RNAi-mediata di superficie e proteine citoplasmatiche in HMVEC-Lung, suggerendo che questa metodologia è compatibile con una varietà di biochimica e screening saggi 20. In sintesi, questo saggio fornisce un facile da usare, modo riproducibile, più funzionale per accedere alla misura dell'attivazione CE da mediatori infiammatori in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche per una neutrofili di successo / endoteliale microvascolare saggio di adesione cellulare sono: 1) Uso di basso numero di passaggio (<9), cellule endoteliali sane; 2) Il mantenimento dei neutrofili isolati a bassa densità (cioè <5 x 10 6 cellule / ml) e il loro utilizzo in due ore di isolamento, e 3) il lavaggio Fastidious dei neutrofili calceina AM-etichettati e l'uso dei neutrofili calceina AM-etichettati in modo tempestivo per ridurre al minimo la contaminazione CE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento UCSF di Cura Anestesia e perioperatoria.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
