Quantitative<em> In vitro</em> Test pour mesurer l'adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

Depuis l'endothélium vasculaire est en contact direct avec le sang circulant, il est situé de façon unique pour initier une réponse inflammatoire rapide lors de l'infection ou de blessure. Les cellules endothéliales (EC) expriment motif récepteurs de reconnaissance qui reconnaissent une variété de composants bactériens conservés et des molécules de danger, et les récepteurs pour les hôtes médiateurs inflammatoires telles que le TNFa. L'activation de ces récepteurs induit EC de sécréter des cytokines (par exemple IL-6, IL-8, CXCL1 et CCL2), et à réguler à la hausse des molécules d'adhésion (par exemple, E / P-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) à leur surface cellulaire ^{1 , 2.} Ces molécules tous facilitent la localisation des leucocytes aux sites d'infection et les blessures afin d'effacer l'hôte des agents infectieux et de lancer la réparation des tissus ^3,4. La réponse des neutrophiles à l'infection implique une interaction bien coordonnée entre l'endothélium vasculaire et la réponse neutrophiles. Lors de l'activation CE, IL-8 est sécrété et forme un gradient intra-vasculaire sur l'endothélium qui permet neutrophiles à l'accueil au site de l'infection ou de blessure ^5,6. E / P-sélectine médiate neutrophiles capture et rouler à travers les associations relativement faibles avec glycomolecules sur la surface des cellules neutrophiles. Ces interactions, avec liaison de l'IL-8 et de ses récepteurs apparentés, facilitent le solide, l'attachement médiée par l'intégrine et arrêt éventuel de neutrophiles à la surface des cellules endothéliales ^7-10. Après l'arrestation, les neutrophiles peuvent migrer hors de la vascularisation des sites spécifiques d'infection à éliminer directement les agents pathogènes, de générer des pièges extracellulaires neutrophiles pour prévenir la propagation d'agents pathogènes, de favoriser la guérison des plaies et libérer des facteurs supplémentaires qui recrutent d'autres leucocytes tels que les monocytes, macrophages et dendritiques cellules ^11-17.

Décrite dans le présent rapport est une méthode in vitro pour quantifier l'adhésion des neutrophiles à microVasculaire ECS après activation par l'hôte médiateur inflammatoire TNF. Ce test est conçu pour évaluer l'activation des EC, et non des neutrophiles. Neutrophiles humains primaires sont d'abord isolés par séparation par gradient de densité, et sont ensuite marquées à la calcéine acétoxyméthylique (AM). Estérases l'intérieur des cellules en direct hydrolyze calcéine AM à la molécule de calcéine hautement fluorescent avec une excitation de 492-495 nm et une émission de 513-516 nm ^18. Les neutrophiles marquées par fluorescence sont ensuite incubés avec des monocouches CE et neutrophiles non adhérentes sont ensuite éliminés. La fluorescence des autres, les neutrophiles lié est ensuite mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence, et calculé en pour cent de l'apport total par fluorescence neutrophiles bien. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les neutrophiles liés calcéine marqués utilisés en spectrophotométrie peuvent être directement visualisées par microscopie à fluorescence pour donner une plus qualitative lire des CE acvation. Depuis cet essai est effectué dans des conditions statiques, seuls les événements très initiales qui se produisent dans la cascade de l'adhésion des neutrophiles seront évalués. Ceci est confirmé dans ce rapport en utilisant des anticorps bloquants E-sélectine à montrer que l'adhésion des neutrophiles au TNFa humain poumon traité CE microvasculaire (HMVEC-Lung) monocouches est considérablement réduite lorsque l'interaction avec E-sélectine est perturbé.

En plus de TNF, nous avons utilisé avec succès ce test pour déterminer l'étendue de la veine activation humaine ombilical CE (HUVEC) par le récepteur Toll-like de 1/2 agonistes lipoprotéine associée à un peptidoglycane (PAL), murein lipoprotéine (MLP) et Pam3Cys et activation HMVEC-Lung par Pam3Cys ^19,20. En outre, nous avons utilisé avec succès ce test avec les inhibiteurs de kinases et après knockdown ARNi médiée de surface et protéines cytoplasmiques dans HMVEC-Lung, ce qui suggère que cette méthode est compatible avec une variété de biochimie et screenindosages g ^20. En résumé, ce test fournit une interface facile à utiliser, de façon reproductible, plus fonctionnel pour accéder à l'importance de l'activation CE par des médiateurs inflammatoires in vitro.