Quantitative<em> In-vitro-</em> Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen
Summary
Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das erlaubt<em> In vitro</em> Quantifizierung von primären humanen Neutrophilen-Bindung an Endothelzellen durch Entzündungsmediatoren unter statischen Bedingungen aktiviert.
Abstract
Die vaskuläre Endothel spielt eine wesentliche Rolle bei der entzündlichen Reaktion. In der akuten Phase der Entzündung werden Endothelzellen (ECs) von Host-Vermittler oder direkt durch konservierte mikrobielle Komponenten oder Host-derived Gefahr Moleküle aktiviert. Activated ECs express Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle, mobilisieren, aktivieren und behalten Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Neutrophile sind die ersten Leukozyten, um anzukommen, und sich an das Endothel durch eine Vielzahl von Adhäsionsmolekülen auf den Oberflächen der beiden Zellen. Die wichtigsten Funktionen von Neutrophilen sind direkt beseitigen mikrobiellen Bedrohungen, die Förderung der Rekrutierung von anderen Leukozyten durch die Freisetzung von zusätzlichen Faktoren, und initiieren Wundheilung. Daher ist die Einstellung und Befestigung des Endothels ein kritischer Schritt in der Einleitung der entzündlichen Reaktion. In diesem Bericht beschreiben wir eine in-vitro-Assay mit neutrophilen AdhäsionCalcein primären humanen Neutrophilen AM-markierten, um das Ausmaß der mikrovaskulären endothelialen Zell-Aktivierung unter statischen Bedingungen zu quantifizieren. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gleichen Proben mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie quantifiziert auch direkt visualisiert werden mittels Fluoreszenzmikroskopie für eine qualitative Bewertung der Neutrophilen-Bindung.
Introduction
Da das vaskuläre Endothel ist in direktem Kontakt mit dem zirkulierenden Blut wird in ausgezeichneter Lage, eine schnelle Entzündungsreaktion während der Infektion oder Verletzung zu initiieren. Endothelzellen (ECs) express pattern recognition receptors, die eine Vielzahl von konservierten bakteriellen Komponenten und Gefahr Moleküle erkennen und Rezeptoren für Host Entzündungsmediatoren wie TNFa. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt ECs, Zytokine (z. B. IL-6, IL-8, CXCL1 und CCL2) sezernieren, und Adhäsionsmoleküle (zB E / P-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1) in ihrer Zelloberfläche 1 hochreguliert , 2. Diese Moleküle alle erleichtern die Lokalisierung von Leukozyten an Stellen der Infektion und Verletzungen, um das Heer der Infektionserreger zu löschen und die Reparatur von Gewebe 3,4 initiieren. Neutrophilen Die Reaktion auf eine Infektion beinhaltet eine gut koordinierte Zusammenspiel zwischen dem vaskulären Endothel und dem antwortenden Neutrophilen. Nach Aktivierung EG, IL-8 abgesondert und bildet einen intravaskulären Gradienten auf das Endothel, die Neutrophilen erlaubt, nach Hause, um den Ort der Infektion oder Verletzung 5,6. E / P-Selektine vermitteln Neutrophilen-Abscheidung und-rollen durch relativ schwache Assoziationen mit glycomolecules auf der neutrophilen Zelloberfläche. Diese Wechselwirkungen, zusammen mit IL-8-Bindung an seinen verwandten Rezeptoren, erleichtern die robust, Integrin-vermittelte Bindung und eventuellen Verhaftung von Neutrophilen am Endothel Zelloberfläche 7-10. Nach Verhaftung kann Neutrophile wandern aus dem Gefäßsystem zu den Austragungsorten der Infektion direkt eliminieren Krankheitserreger erzeugen Neutrophilen extrazellulären Fallen, um die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern, die Wundheilung fördern und lassen weitere Faktoren, die andere Leukozyten wie Monozyten, Makrophagen und dendritischen rekrutieren Zellen 11-17.
Beschrieben in diesem Bericht ist ein in vitro-Methode, um die Einhaltung der neutrophilen MicroV quantifizierenascular ECs nach Aktivierung durch den Host Entzündungsmediatoren TNF. Dieser Test wurde entwickelt, um die Aktivierung von Endothelzellen und nicht für Neutrophile zu bewerten. Primäre humane Neutrophile sind zunächst getrennt mit Dichtegradiententrennung, und werden dann mit Calcein acetoxymethyl (AM) markiert. Esterasen innerhalb der lebenden Zellen hydrolysieren Calcein AM zu stark fluoreszierenden Calcein Molekül mit einer Anregung von 492-495 nm und die Emission von 513-516 nm 18. Die Fluoreszenz-markierten Neutrophilen werden dann mit EC Monoschichten inkubiert und nicht-adhärente Neutrophile werden anschließend entfernt. Die Fluoreszenz der verbleibenden gebundenen Neutrophilen wird dann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Spektralphotometer, berechnet und als Prozentsatz der gesamten Neutrophilen Fluoreszenz Eingang pro Vertiefung. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gebundenen Calcein-markierten Neutrophilen in Spektrofotometrie direkt verwendet werden kann, visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskopie, um eine qualitative aus EG ac lesen gebenMotivation. Da dieser Test unter statischen Bedingungen durchgeführt wird, werden nur die ersten Ereignisse, die sehr in der neutrophilen Adhäsionskaskade auftreten beurteilt werden. Dies wird in diesem Bericht mit E-Selektin blockierende Antikörper gegen diese Neutrophilen Einhaltung TNF-behandelten menschlichen Lunge mikrovaskulären EC (HMVEC-Lung) Monoschichten wird drastisch reduziert, wenn die Interaktion mit E-Selektin gestört zeigen bestätigt.
Neben TNF, haben wir erfolgreich diesen Test verwendet werden, um das Ausmaß der menschlichen Nabelschnur-EC (HUVEC) Aktivierung durch den Toll-like-Rezeptor-1/2-Agonisten peptidoglycan Lipoprotein-assoziierte (PAL), Murein-Lipoprotein (MLP) und Pam3Cys und bestimmen HMVEC-Lung Aktivierung durch Pam3Cys 19,20. Darüber hinaus haben wir erfolgreich verwendet diesen Test mit Kinase-Inhibitoren und nach RNAi-vermittelter Knockdown von Oberfläche und zytoplasmatische Proteine in HMVEC-Lung, was darauf hindeutet, dass diese Methode kompatibel mit einer Vielzahl von biochemischen und ist screening Assays 20. Zusammenfassend stellt dieser Test ein leicht, reproduzierbar, funktioneller Weise zu verwenden, um das Ausmaß der EG-Aktivierung durch Entzündungsmediatoren in vitro zu übersetzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Neutrophilen / Mikrogefäßendothelzellen Zelladhäsionsassay sind: 1) der niedrigen Passage-Nummer (<9), gesunde Endothelzellen Verwenden; 2) Pflege der isolierten Neutrophilen bei einer geringen Dichte (dh <5 x 10 6 Zellen / ml) und mit ihnen innerhalb von zwei Stunden der Isolation, und 3) Fastidious Waschen der Calcein AM-markierten Neutrophilen und die Nutzung der Calcein AM-markierten Neutrophilen rechtzeitig EG Verschmutzung und Verlust von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der UCSF Abteilung Anästhesie und perioperative Pflege unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
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