Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро
Summary
Спасение рекомбинантных аренавирусы из клонированных кДНК, подход называют обратной генетики, позволяет исследователям исследовать роль специфических вирусных генных продуктов, а также вклад их различных конкретных областях и остатки, ко многим различным аспектам биологии ареновирус . Кроме того, методы обратной генетики в FDA утвержденных клеточных линий (Vero) для разработки вакцины обеспечивает новые возможности для создания эффективных и безопасных вакцин для борьбы человека аренавирусы патогенными.
Abstract
Разработка и реализация ареновирус обратной генетики представляет собой значительный прорыв в 4 поля ареновирус. Использование клеточных ареновирус минигеном систем вместе с способность генерировать рекомбинантного инфекционного аренавирусы с заданными мутациями в их геномах способствовал исследованию вклада вирусных детерминант в различных этапах жизненного цикла ареновирус, а также вирус-хозяин взаимодействий и механизмов ареновирус патогенез 1, 3, 11. Кроме того, развитие trisegmented аренавирусы разрешил использование ареновирус генома выразить дополнительную интерес чужеродных генов, тем самым открывая возможность ареновирус вакцины на основе вектора приложения 5. Кроме того, развитие однотактную инфекционных аренавирусы способны выразить гены репортер обеспечивает новый экспериментальный инструмент для повышения безопасности исследований с участием Highlу человека патогенных аренавирусы 16. Поколение рекомбинантных аренавирусы использованием плазмиды на основе обратной генетики до сих пор полагались на использование линий грызунов клетки 7,19, что создает некоторые препятствия для развития пищевых продуктов и медикаментов (FDA)-лицензированной вакцины или вакцины векторов. Чтобы преодолеть это препятствие, мы описываем здесь эффективное производство рекомбинантных аренавирусы в FDA утвержденных Vero клеток.
Introduction
Аренавирусы окутаны вирусов с bisegmented, отрицательная РНК генома 3, которые принадлежат к семейству Arenaviridae. Ареновирус генома кодирует белки в четыре ambisense моды из двух отдельных вирусных сегментов 3. Большой (L) сегмент кодирует РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) и малое кольцо (действительно интересный новый ген) палец белка (Z), которая служит главной движущей силой вируса почкованием. Маленький (S) сегмент кодирует вирусный нуклеопротеина (NP), а поверхность гликопротеина (GP) (рис. 1).
Несколько членов семьи Arenaviridae ответственны за смертельные геморрагические лихорадки (HF) в организме человека 3. Из принципа опасения вируса Ласса (LASV) и вирус Хунин (JUNV), который как известно, вызывают высокую смертность у больных, госпитализированных 8, 9. Хотя эти вирусы являются эндемичными для Западной Африки и сельских Аргентине, соответственно,Есть растущую озабоченность ввоза LASV и JUNV чтобы не эндемичных районах в связи с увеличением числа поездок 10. Кроме того, хотя обычно не связаны с тяжелыми заболеваниями у людей, прототип ареновирус лимфоцитарные хориоменингита (LCMV) считается возбудителем пренебречь, поскольку были случаи смертельных инфекций у пациентов с иммунодефицитом 6, 15 и отвечает за врожденные аномалии и спонтанные аборты у беременных женщин, 2, 13. Пока ни один американский FDA-разрешенных вакцин против аренавирусы и лечение ограничивается аналог нуклеозидов рибавирином, которая лишь частично эффективны и часто связано со значительными побочными эффектами.
Внедрение на основе плазмиды обратной генетики и 4 поколение рекомбинантных аренавирусы 7, 19 в значительной степени продвинули области ареновирус исследований. В настоящее время клетки грызунов (например, ВНК-21) используются для вообще говоряAtion рекомбинантных аренавирусов из-за видоспецифических мышиной РНК-полимеразы I (поли-I) промотор, направляющий начальной транскрипции S и L сегментов. Однако вирус спасения в клетках ВНК-21 не утвержденного метода получения рекомбинантных аренавирусы в качестве потенциальных кандидатов семян вакцины. Здесь мы документировать использование человеческих POL-я промоутер для эффективного спасения прототипом Старого Света (OW) LCMV и Новый Свет (NW) JUNV Откровенный № 1 напряжения в клетках Vero. Использование аналогичной методологии, мы получили рекомбинантный trisegmented LCMV (r3LCMV) и откровенной № 1 (r3Candid # 1) аренавирусы, которые содержат два дополнительных чужеродные гены закодированы в двух различных сегментов РНК S 5. Эта новая система не только следует высокой воспроизводимостью и простой протокол, но могут быть непосредственно реализованы в получения рекомбинантных аренавирусов как потенциальные вакцины или семена вакцинного вектора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генерация рекомбинантного аренавирусы использованием плазмиды на основе обратной генетики стала широко используемый подход для исследования различных аспектов ареновирус биологии. Здесь мы документе решающую совершенствования нынешней системы, выполняя ареновирус спасает в Веро-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank past and present members in JCT and LM-S laboratories for the development and improvement of the arenavirus reverse genetics techniques and plasmids. We also thank Snezhana Dimitrova for technical support. The monoclonal antibody directed to JUNV NP (SA02-BG12) was obtained from BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository). BYHC was supported by Grant Number GM068411 from Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R is a Fullbright-Conicyt (BIO 2008) and a Rochester Vaccine Fellowship (2012) recipient. EO-R current support is provided by a postdoctoral Fellowship for Diversity & Academic Excellence from the Office for Faculty Development & Diversity at the University of Rochester. Research in LM-S laboratory is funded by the NIH grants RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, the NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (HHSN266200700008C), and The University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).
Research at JCT laboratory was supported by grants RO1 AI047140, RO1 AI077719, and RO1 AI079665 from NIH.
Materials
| Material and methods | |||
|
Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields’ Virology. 2, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
