Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero
Summary
Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e sicuri per combattere arenavirus patogeni umani.
Abstract
Lo sviluppo e l'attuazione di arenavirus genetica inversa rappresenta un significativo passo avanti nel campo 4 arenavirus. L'uso di sistemi minigenome Arenavirus base di cellule insieme con la capacità di generare ricombinanti arenaviruses infettive con mutazioni predeterminate nei loro genomi ha facilitato l'indagine del contributo dei determinanti virali nelle diverse fasi del ciclo di vita arenavirus, così come virus-ospite interazioni e meccanismi di patogenesi arenavirus 1, 3, 11. Inoltre, lo sviluppo di arenaviruses trisegmented ha permesso l'utilizzo del genoma arenavirus di esprimere ulteriori geni estranei di interesse, aprendo così la possibilità di applicazioni vettore di vaccino arenavirus basati 5. Analogamente, lo sviluppo di ciclo unico arenaviruses infettivi capaci di esprimere geni reporter fornisce un nuovo strumento sperimentale per migliorare la sicurezza di ricerca che coinvolge highly patogeni arenavirus umani 16. La generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based ha finora invocato l'uso di linee cellulari di roditori 7,19, il che pone alcune barriere per lo sviluppo di Food and Drug Administration (FDA) con licenza vaccino o di vettori vaccinali. Per superare questo ostacolo, si descrive qui la generazione efficiente di arenavirus ricombinanti in cellule Vero approvato dalla FDA.
Introduction
Arenavirus sono virus con involucro con bisegmented, negativo-stranded RNA del genoma 3 che appartengono alla famiglia Arenaviridae. Il genoma codifica arenavirus quattro proteine in modo ambisense da due segmenti virali separati 3. Il grande segmento (L) codifica per la RNA polimerasi RNA-dipendente (L) e il piccolo anello (davvero interessante nuovo gene) finger proteina (Z), che serve come il principale motore di virus in erba. Il piccolo (S) segmento codifica la nucleoproteina virale (NP) e la glicoproteina di superficie (GP) (Figura 1).
Diversi membri della famiglia Arenaviridae sono responsabili della febbre emorragica letale (HF) in esseri umani 3. Di principio preoccupazioni sono virus Lassa (LASV) e virus Junin (JUNV), che sono noti per causare un'elevata mortalità nei pazienti ospedalizzati 8, 9. Anche se questi virus sono endemiche in Africa occidentale e rurale Argentina, rispettivamente,vi sono preoccupazioni crescenti di importazione di LASV e JUNV ad aree non endemiche a causa di un aumento di viaggio 10. Inoltre, anche se normalmente non associata a malattia grave nell'uomo, il arenavirus prototipo virus coriomeningite linfocitaria (LCMV) è considerato un agente patogeno trascurato in quanto non vi sono stati casi di infezione letale in pazienti immunocompromessi 6, 15 ed è responsabile per i difetti congeniti alla nascita e aborti spontanei in donne in gravidanza 2, 13. Attualmente non ci sono US FDA ha approvato i vaccini contro arenavirus e il trattamento è limitato al nucleoside analogo ribavirina, che è solo parzialmente efficace e spesso associata a significativi effetti collaterali.
L'introduzione di inversione plasmide a base genetica 4 e la generazione di ricombinanti arenavirus 7, 19 hanno notevolmente migliorato il campo di ricerca arenavirus. Attualmente, cellule di roditore (come BHK-21) vengono utilizzati per la generzione di arenaviruses ricombinanti dovute alla specie-specifico murino RNA polimerasi I (pol-I) promotore dirigere la trascrizione iniziale della S e L segmenti. Tuttavia virus salvataggio in cellule BHK-21 non sono un metodo approvato per la generazione di ricombinanti arenavirus come potenziali candidati di semi vaccino. Qui documentiamo l'uso del umano pol-I promoter di soccorso efficiente del prototipo Vecchio Mondo (OW) LCMV e il Nuovo Mondo (NW) JUNV Candid # 1 ceppo di cellule Vero. Utilizzando una metodologia simile, abbiamo generato ricombinante trisegmented LCMV (r3LCMV) e Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavirus che contengono due geni estranei aggiuntivi codificati in due diversi segmenti di RNA S 5. Questo nuovo sistema segue non solo un protocollo altamente riproducibile e semplice ma può essere immediatamente attuata la generazione di arenaviruses ricombinanti come potenziale vaccino o semi vettore vaccino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based è diventata un metodo ampiamente utilizzato per lo studio di molti e diversi aspetti della biologia arenavirus. Qui documentiamo un miglioramento fondamentale per l'attuale sistema eseguendo arenavirus salvataggi su cellule Vero, consentendo la potenziale generazione di candidati vaccini approvati dalla FDA contro arenavirus e vettori di vaccini contro altre malattie infettive.
Le procedure sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri passati e presenti in JCT e laboratori LM-S per lo sviluppo e il miglioramento delle tecniche di Arenavirus inversa e plasmidi genetica. Ringraziamo anche Snezhana Dimitrova per il supporto tecnico. L'anticorpo monoclonale diretto a JUNV NP (SA02-BG12) è stato ottenuto da BEI Risorse (NIAID Biodefense ed Emerging Infections Research Resources Repository). BYHC è stato sostenuto da Grant Numero GM068411 da Institutional Ruth L. Kirschstein Servizio Nazionale Research Award. EO-R è un Fullbright-CONICYT (BIO 2008) e di un Rochester Vaccino Fellowship (2012) del destinatario. Supporto corrente EO-R è fornita da una borsa di studio postdottorato per la diversità e l'eccellenza accademica presso l'Ufficio per lo sviluppo delle capacità e diversità presso l'Università di Rochester. La ricerca in laboratorio LM-S è finanziato dal NIH sovvenzioni RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, i Centri NIAID di Eccellenza per l'influenza di ricerca e di sorveglianza (HHSN266200700008C), eL'Università di Rochester Centro per Biodefense Modeling Immune (HHSN272201000055C).
La ricerca presso il laboratorio JCT è stato sostenuto da sovvenzioni RO1 AI047140, RO1 AI077719, e RO1 AI079665 dal NIH.
Materials
| Material and methods | |||
|
Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields’ Virology. 2, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
