Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero
Summary
Resgate de arenavírus recombinantes a partir de ADNc clonados, uma abordagem designada por genética reversa, permite aos investigadores para investigar o papel dos produtos de genes virais específicos, bem como a contribuição dos seus vários domínios e resíduos específicos, de diferentes aspectos da biologia do arenavírus . Da mesma forma, inverter técnicas de genética em linhas de células aprovadas pela FDA (Vero) para o desenvolvimento da vacina proporciona novas possibilidades para a produção de vacinas eficazes e seguras para combater arenavírus patogénicos humanos.
Abstract
O desenvolvimento e implementação de arenavírus reversa genética representa um avanço significativo no campo 4 arenavírus. A utilização de sistemas de arenavírus minigenome baseados em células, juntamente com a capacidade de gerar arenavírus infecciosos recombinantes com mutações predeterminadas nos seus genomas facilitou a investigação da contribuição dos determinantes virais para as diferentes etapas do ciclo de vida arenavírus, bem como vírus-hospedeiro interacções e mecanismos de patogénese arenavírus 1, 3, 11. Além disso, o desenvolvimento de arenavírus trisegmented tem permitido a utilização do genoma arenavírus para expressar genes estranhos adicionais de interesse, criando assim a possibilidade de uma aplicação vector de vacina à base de arenavírus 5. Do mesmo modo, o desenvolvimento de arenavírus infecciosas único ciclo capaz de expressar genes repórter proporciona uma nova ferramenta experimental para melhorar a segurança de pesquisa envolvendo highly patogênicos arenavírus humanos 16. A geração de arenavírus recombinantes utilizando técnicas de genética reversa baseados em plasmídeo, até agora contou com a utilização de linhas de células de roedores 7,19, o que coloca algumas barreiras para o desenvolvimento da Food and Drug Administration (FDA) licenciado vacina ou vetores vacinais. Para superar esse obstáculo, descrevemos aqui a geração eficiente de arenavírus recombinantes em células Vero FDA-aprovados.
Introduction
Arenavírus são vírus com envelope com um bisegmented, genoma de RNA de cadeia negativa 3, que pertencem à família Arenaviridae. O genoma arenavírus codifica quatro proteínas de maneira AMBISENSE a partir de dois segmentos virais independentes 3. O segmento de grande (L) codifica a RNA polimerase dependente de RNA (L) eo pequeno anel (Really Interesting New Gene) proteína dedo (Z), que serve como a principal força motriz do vírus da brotação. O segmento pequeno (S) codifica a nucleoproteína viral (NP) e da glicoproteína de superfície (GP) (Figura 1).
Vários membros da família Arenaviridae são responsáveis pela febre hemorrágica letal (HF) 3 em seres humanos. Das preocupações principais são vírus de Lassa (LASV) e vírus Junín (JUNV), que são conhecidos por causar alta mortalidade em pacientes hospitalizados, 8, 9. Embora esses vírus são endêmicos para a África Ocidental e rural Argentina, respectivamente,há preocupações crescentes de importação de LASV e JUNV para áreas não endêmicas, devido ao aumento de viagem para 10. Além disso, embora não seja normalmente associada com doença grave em humanos, o arenavírus protótipo vírus choriomeningitis linfocítica (LCMV) é considerado um patógeno negligenciado como tem havido casos de infecção letal em pacientes imunocomprometidos, 6, 15 e é responsável por defeitos congênitos e abortos espontâneos em mulheres grávidas, 2, 13. Actualmente não há EUA aprovados pela FDA vacinas contra arenavírus e tratamento é limitada ao nucleósido análogo ribavirina, que é apenas parcialmente eficaz e, muitas vezes associada com efeitos colaterais significativos.
A introdução de reverse-base plasmídeo genética 4 e geração de arenavírus recombinantes 7, 19 têm avançado muito no campo da pesquisa arenavírus. Actualmente, as células de roedores (tais como BHK-21) são utilizados para o Generção de arenavírus recombinantes devido à específica da espécie murina RNA polimerase I (pol-I) promotora dirigir a transcrição inicial dos segmentos L e S. No entanto salvamento vírus em células BHK-21 não são um método aprovado para a geração de arenavírus recombinantes como vacinas candidatas potenciais de sementes. Aqui vamos documentar o uso do ser humano pol-I promotor de resgate eficiente do Velho Mundo protótipo (OW) LCMV eo Novo Mundo (NW) JUNV Candid º 1 tensão em células Vero. Utilizando uma metodologia similar, geramos LCMV recombinante trisegmented (r3LCMV) e Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavírus que contêm dois genes estranhos adicionais codificados em dois segmentos de RNA é diferente 5. Este novo sistema não só segue um protocolo altamente reprodutível e simples, mas pode ser imediatamente implementado na geração de arenavírus recombinantes como vacinas potenciais ou sementes vector de vacina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geração de arenavírus recombinantes utilizando técnicas de genética reversa baseados plasmídeo tornou-se uma abordagem amplamente utilizado para a investigação de muitas facetas diferentes de biologia arenavírus. Aqui nós documentar uma melhoria crucial para o atual sistema através da realização de arenavírus resgata em células Vero, permitindo o potencial de geração de vacinas candidatas aprovadas pela FDA contra arenavírus e vetores de vacinas contra outras doenças infecciosas.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos membros passados e presentes em JCT e laboratórios LM-S para o desenvolvimento e melhoria das técnicas de genética reversa arenavírus e plasmídeos. Agradecemos também Snezhana Dimitrova para suporte técnico. O anticorpo monoclonal dirigido para JUNV NP (SA02-BG12) foi obtido a partir de BEI Recursos (NIAID Biodefesa e Infecções Repositório de Recursos de Investigação). BYHC foi apoiado por Grant Número GM068411 Institucional de Ruth L. Prêmio por Serviço Nacional de Investigação Kirschstein. EO-R é um Fullbright-Conicyt (BIO 2008) e uma bolsa de Rochester Vaccine (2012) destinatário. Suporte atual EO-R é fornecida por uma bolsa de pós-doutorado para a Diversidade e Excelência Acadêmica do Gabinete para o Desenvolvimento Professores e Diversidade na Universidade de Rochester. Research in LM-S laboratório é financiado pelo NIH concede RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, os Centros de Excelência NIAID para Influenza Pesquisa e Vigilância (HHSN266200700008C) eA Universidade de Rochester Center for Biodefense Modeling Imune (HHSN272201000055C).
Pesquisa da JCT laboratório foi suportado por concessões RO1 AI047140, RO1 AI077719 e SR1 AI079665 do NIH.
Materials
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Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
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