Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen
Summary
Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter bestrijding humane pathogene arenavirussen.
Abstract
De ontwikkeling en implementatie van arenavirus reverse genetics is een belangrijke doorbraak in het areanavirus veld 4. Het gebruik van cel-gebaseerde arenavirus minigenoom systemen samen met de mogelijkheid om recombinant infectueus arenavirussen met voorafbepaalde veranderingen in hun genomen te genereren is het onderzoek naar de bijdrage van virale determinanten van de verschillende stappen van de arenavirus levenscyclus, en virus-gastheer vergemakkelijkt interacties en mechanismen van pathogenese arenavirus 1, 3, 11. Bovendien is de ontwikkeling van trisegmented arenavirussen toegelaten gebruik van de arenavirus genoom aanvullende vreemde genen van interesse en aldus de mogelijkheid van arenavirus gebaseerd vaccin vector toepassingen 5 openen. Ook aan een enkele cyclus infectieuze arenavirussen kan uitdrukken reporter genen verschaft een nieuwe experimentele methode om de veiligheid van onderzoek met highl verbetereny pathogene menselijke arenaviruses 16. De generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken heeft tot nu toe vertrouwd op het gebruik van knaagdieren cellijnen 7,19, die enkele barrières voor de ontwikkeling van de Food and Drug Administration (FDA)-licentie vaccin of vaccinvectoren poses. Om dit obstakel te overwinnen, beschrijven we hier de efficiënte productie van recombinante arenaviruses in FDA-goedgekeurde Vero-cellen.
Introduction
Arenaviruses zijn omhulde virussen met een bisegmented, negatieve-stranded RNA genoom 3 die behoren tot de familie Arenaviridae. De arenavirus genoom codeert vier eiwitten in een ambisense mode uit twee afzonderlijke virale segmenten 3. De grote (L) segment codeert het RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L) en de kleine RING (Really Interesting New Gene) vinger eiwit (Z), dat fungeert als de belangrijkste drijvende kracht van het virus ontluikende. Het kleine (S) segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en het oppervlak glycoproteïne (GP) (figuur 1).
Verscheidene leden van de familie Arenaviridae verantwoordelijk voor dodelijke hemorrhagic fever (HF) bij mensen 3. Principiële zorgen zijn Lassa virus (LASV) en Junín virus (JUNV), waarvan bekend is dat hoge mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten 8, 9 veroorzaken. Hoewel deze virussen zijn endemisch in West-Afrika en landelijke Argentinië, respectievelijk,er zijn toenemende bezorgdheid van de invoer van LASV en JUNV naar niet-endemische gebieden als gevolg van verhoogde reizen 10. Bovendien, hoewel niet gewoonlijk geassocieerd met ernstige ziekten bij de mens, is het prototype arenavirus lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV) beschouwd als een verwaarloosde pathogeen als er gevallen van dodelijke infecties zijn in immuungecompromitteerde patiënten 6, 15 en is verantwoordelijk voor aangeboren afwijkingen en spontane abortussen bij zwangere vrouwen 2, 13. Momenteel zijn er geen FDA-goedgekeurde vaccins tegen arenavirussen en behandeling is beperkt tot het nucleoside analoog ribavirine, die slechts gedeeltelijk effectief en vaak geassocieerd met significante bijwerkingen.
De introductie van plasmide-gebaseerde reverse genetics 4 en generatie van recombinant arenaviruses 7, 19 zijn sterk vooruitgegaan op het gebied van arenavirus onderzoek. Momenteel worden cellen van knaagdieren (zoals BHK-21) voor de algeatie van recombinant arenavirussen door de soortspecifieke murine RNA polymerase I (pol-I) promoter de transcriptie van de eerste S en L segmenten. Echter virus rescue in BHK-21 cellen geen goedgekeurde methode voor het genereren van recombinant arenavirussen als potentieel vaccin kandidaten zaad. Hier documenteren wij het gebruik van de menselijke pol-I promotor voor doeltreffende redding van de prototypische Oude Wereld (OW) LCMV en de Nieuwe Wereld (NW) JUNV Candid # 1 stam in Vero-cellen. Met behulp van een soortgelijke methodologie, we gegenereerd recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses dat twee extra vreemde genen gecodeerd in twee verschillende S-RNA-segmenten 5 bevatten. Dit nieuwe systeem volgt niet alleen een zeer reproduceerbare en eenvoudig protocol maar kunnen onmiddellijk worden toegepast bij de vorming van recombinante arenavirussen als potentiële vaccins of vaccin vector zaden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken is uitgegroeid tot een veel gebruikte aanpak voor het onderzoeken van vele verschillende facetten van arenavirus biologie. Hier documenteren we een cruciale verbetering van het huidige systeem door het uitvoeren arenavirus reddingen in Vero-cellen, waardoor de potentiële productie van FDA-goedgekeurde kandidaten vaccin tegen arenaviruses en vaccinvectoren tegen andere besmettelijke ziekten.
D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken heden en verleden leden in JCT en LM-S laboratoria voor de ontwikkeling en verbetering van de arenavirus reverse genetics technieken en plasmiden. We danken ook Snezhana Dimitrova voor technische ondersteuning. Het monoklonaal antilichaam gericht om JUNV NP (SA02-BG12) werd verkregen van BEI Resources (NIAID Biodefense en opkomende infecties Research Resources Repository). BYHC werd ondersteund door Grant Number GM068411 van Institutionele Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R is een Fulbright-Conicyt (BIO 2008) en een Rochester Vaccin Fellowship (2012) ontvanger. EO-R huidige ondersteuning wordt geleverd door een postdoctorale Fellowship voor Diversiteit & Academic Excellence van het Bureau voor Faculty Development & Diversiteit aan de Universiteit van Rochester. Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidie RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), enDe Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).
Onderzoek bij JCT laboratorium werd ondersteund door subsidies RO1 AI047140, RO1 AI077719 en RO1 AI079665 van NIH.
Materials
| Material and methods | |||
|
Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
References
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields’ Virology. 2, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
