Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury
Summary
A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.
Abstract
Después de ictus cerebral microglia / macrófagos (M / M) se someten a una activación rápida con cambios morfológicos y fenotípicos dramáticos que incluyen la expresión de antígenos de superficie y producción de nuevos mediadores que construyen y mantienen la respuesta inflamatoria. Nuevas pruebas indican que M / M son células altamente plástico que pueden asumir anti-inflamatorio de activación clásica pro-inflamatoria (M1) o alternativa (M2) después de la lesión cerebral aguda. Sin embargo, una caracterización completa de M / M marcador expresión fenotipo, su colocalización y evolución temporal en el cerebro lesionado sigue desaparecido.
Protocolos de tinción de inmunofluorescencia específicamente marcadores pertinentes de la activación M / M se pueden realizar en el cerebro isquémico. Aquí presentamos protocolos basados en inmunofluorescencia seguido por análisis confocal tridimensional como un enfoque poderoso para investigar el patrón de localización y co-expresión de marcadores de fenotipo M / M, tales comoCD11b, CD68, Ym1, en modelo de ratón de isquemia focal inducida por la oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO). Análisis bidimensional de la zona manchada revela que cada marcador se asocia a una morfología M / M definido y tiene una localización dada en la lesión isquémica. Patrones de M / M marcador de fenotipo co-expresión puede evaluarse de imagen confocal tridimensional en la zona isquémica. Las imágenes pueden ser adquiridas en un volumen definido (10 micras Z-eje y un tamaño de 0,23 micras paso, que corresponde a un volumen de 180 x 135 x 10 micras) con un modo de escaneo secuencial para minimizar los efectos de sangrado a través de la longitud de onda y evitar la superposición. Las imágenes se procesaron a continuación para obtener representaciones en tres dimensiones por medio de un software Imaris. Vista sólido de tres representaciones tridimensionales permite la definición de la expresión del marcador en grupos de células. Se demuestra que M / M tienen la capacidad de diferenciarse hacia una multitud de fenotipos, dependiendo de la localización en el sitio de la lesión y Timí después de la lesión.
Introduction
Después de una lesión cerebral aguda, microglia se activan rápidamente y se someten morfológica dramática y fenotípica cambios 1-3. Esta respuesta intrínseca está asociada a la contratación de los macrófagos de origen sanguíneo que migran en el 4,5 parénquima cerebral lesionado. El papel de los macrófagos y microglia que antigénicamente no son distinguibles (en adelante el M / M) en el daño cerebral es todavía debatido. Un número creciente de estudios indican que, de manera similar a lo descrito para los macrófagos periféricos, la microglía y los macrófagos reclutados cerebro pueden asumir diferentes fenotipos cuyos extremos corresponden a classic pro-inflamatoria tóxica (M1) o de protección (M2) fenotipo antiinflamatorio. Los diferentes estados de activación, incluyendo la secreción de factores pro-o anti-inflamatorias, la liberación de moléculas neurotróficas y la actividad lisosomal se caracterizan por un patrón específico de marcadores fenotípicos, cuya expresión depende de lo temporalevolución del entorno circundante. La caracterización de estos fenotipos M / M en el cerebro lesionado es todavía escasa. Se utilizó un modelo murino bien establecida de pMCAo para analizar la expresión M / M y la evolución después del accidente cerebrovascular. Protocolos de inmunofluorescencia con base aquí presentados tienen como objetivo conseguir una idea de la apariencia de los marcadores específicos de M / M fenotipo, su localización y celular co-expresión en el área isquémica. Investigamos unas pocas moléculas asociadas a diferentes estado de activación o fenotipo, es decir, CD11b, un marcador de superficie expresada por los leucocitos y un marcador ampliamente utilizado de M / M de activación / contratación 6-8, CD68 un marcador de lisosomas 6,7 y YM1 un secretora proteína expresada por activados alternativamente (M2) y los macrófagos asociados a la recuperación y restauración de la función 9-10.
Cuando dos marcadores son expresados por la misma célula, pero en diferentes compartimentos subcelulares, colocalización por sí sola no puede ser mucho informative. En este caso, el análisis de coexpresión se puede realizar mediante el uso de una sola vista en planta y por las representaciones tridimensionales. Estamos aquí describir un protocolo para obtener un análisis tridimensional completo de coexpresión del marcador.
Protocol
Representative Results
Discussion
We present here immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate localization and co-expression of M/M phenotype markers into the ischemic area (for a more detailed analysis see ref 6). This method combines specific staining of relevant marker of M/M activation with three-dimensional confocal imaging. The fine tuning of antibodies, serum and fluorconjugated working dilutions allows optimal signal to noise ratio of the investigated m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stefano Fumagalli is a fellow of the Monzino Foundation.
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
References
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