ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית
Summary
דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.
Abstract
לאחר מיקרוגליה שבץ המוחי / מקרופאגים (ז / ז) עובר שפעול מהיר עם שינויים מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים הכוללים ביטוי של פני השטח אנטיגנים רומן וייצור של מתווכים כי לבנות ולתחזק את התגובה הדלקתית. ראיות מצביעות על כך שמתעוררים M / M הם תאי פלסטיק מאוד שיכול להניח הפעלה קלאסית פרו דלקתית (M1) או חלופית אנטי דלקתית (M2) לאחר פגיעה מוחית חריפה. עם זאת אפיון של ביטוי M / M סמן פנוטיפ, colocalization והתפתחות הטמפורלית במוח נפגע מלא עדיין חסר.
פרוטוקולי Immunofluorescence במיוחד מכתימים סמנים רלוונטיים של הפעלת M / M יכולים להתבצע במוח איסכמי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הדפוס של לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M כגוןCD11b, CD68, Ym1, במודל של עכברים של איסכמיה מוקד הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי (pMCAO). ניתוח דו ממדי של האזור המוכתם מגלה כי כל סמן קשור למורפולוגיה M / M מוגדר ויש לו לוקליזציה נתון בנגע איסכמי. דפוסים של שיתוף ביטוי סמן פנוטיפ M / M ניתן להעריך על ידי confocal הדמיה תלת ממדית באזור איסכמי. ניתן לרכוש תמונות על נפח מוגדר (10 מיקרומטר Z-ציר וגודל צעד 0.23 מיקרומטר, המקביל ל 180 x 135 x 10 מיקרומטר נפח) עם מצב סריקה רציף כדי למזער את ההשפעות לדמם דרך ולהימנע מגל חופף. אז תמונות מעובדות להשיג הדמיות תלת ממדיות באמצעות תוכנת Imaris. השקפה מוצקה של שלוש הדמיות ממדיות מאפשרת ההגדרה של ביטוי סמן באשכולות של תאים. אנחנו מראים שיש לי M / M היכולת להבדיל כלפי מספר רב של פנוטיפים, תלוי במיקום באתר הנגע וtiשלי אחרי פציעה.
Introduction
לאחר פגיעה מוחית חריפה, מיקרוגליה במהירות מופעלים ולעבור מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים משתנים 1-3. תגובה מהותית זה קשור לגיוס של מקרופאגים יליד דם אשר נודדים לתוך 4,5 parenchyma המוח נפגע. התפקיד של מיקרוגליה ומקרופאגים אשר antigenically לא להבחין (המכונה מעתה כז / ז) בפגיעה מוחית עדיין במחלוקת. מספר גדל והולך של מחקרים מצביע על כך, באופן דומה למה שתאר למקרופאגים היקפיים, מיקרוגליה ומוח מגויסים מקרופאגים יכולים להניח פנוטיפים שונים קיצוניות שמתאימה לרעיל קלאסי הפרו דלקתי (M1) או הפנוטיפ אנטי דלקתי מגן (M2). מצבי ההפעלה השונים, כולל הפרשה של גורמים פרו או אנטי דלקתיים, שחרורו של מולקולות נוירוטרופי ופעילות lysosomal מתאפיינים בדפוס מסוים של סמנים פנוטיפי, ביטוי שתלוי בזמןאבולוציה של הסביבה. האפיון של פנוטיפים M / M אלה במוח נפגע הוא עדיין מועט. אנחנו השתמשנו במודל עכברי מבוסס היטב של pMCAo לנתח ביטוי M / M ואבולוציה לאחר שבץ. פרוטוקולי Immunofluorescence מבוססים שהוצגו כאן שואפים לקבל תובנה המראה של סמנים ספציפיים M / M פנוטיפ, הלוקליזציה שלהם ושיתוף ביטוי סלולארי באזור איסכמי. אנחנו בדקנו כמה מולקולות הקשורות למצב הפעלה שונה או פנוטיפ, כלומר CD11b, סמן משטח לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות וסמן בשימוש נרחב של הפעלה / גיוס M / M 6-8, CD68 סמן של lysosomes 6,7 וYm1 הפרשה חלבון לידי ביטוי על ידי מקרופאגים מופעלים לחלופין (M2) וקשורה להחלמה ושיקום תפקוד 9-10.
כאשר שני סמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו התא, אך בתאי subcellular שונים, colocalization לבד לא יכול להיות הרבה informative. במקרה זה, ניתוח של coexpression יכול להתבצע על ידי שימוש בתצוגת מישור אחד וע"י הדמיות תלת ממד. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול כדי להשיג ניתוח תלת ממדים יסודי של coexpression סמן.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים כאן פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי (לניתוח מפורט יותר ראה נ"צ 6). שיטה זו משלבת מכתים ספציפי של סמן הרלוונטי של הפעלת M / M עם confocal הדמיה תלת ממדית. ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
סטפנו פומגלי הוא עמית של קרן Monzino.
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
- Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
- Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
- Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
- Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
- Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).
