Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel
Summary
A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.
Abstract
Na hersenenslag microglia / macrofagen (M / M) ondergaan snelle activering met dramatische morfologische en fenotypische veranderingen die expressie van het nieuwe oppervlakte-antigenen en productie van mediatoren die de opbouw en de ontstekingsreactie te handhaven omvatten. Opkomende bewijs geeft aan dat M / M zijn zeer plastic cellen die klassieke pro-inflammatoire (M1) of een andere anti-inflammatoire (M2) activering na een acuut hersenletsel kan aannemen. Maar een volledige karakterisering van M / M fenotype markerexpressie, hun colocalization en temporele evolutie in de beschadigde brein is nog steeds vermist.
Immunofluorescentie specifiek beoordeelt kleuring relevante markers van M / M activering kan worden uitgevoerd in de ischemische hersenen. Hier presenteren we immunofluorescentie gebaseerde protocollen gevolgd door drie-dimensionale confocale analyse als een krachtige aanpak om het patroon van lokalisatie en co-expressie van M / M fenotype merkers zoals onderzoekenCD11b, CD68, Ym1, in muismodel ischemie geïnduceerd door permanente occlusie van de middelste cerebrale slagader (pMCAO). Tweedimensionale analyse van de vlek zien dat elke merker is gekoppeld aan een bepaalde M / M morfologie en een gegeven locatie in het ischemische letsel. Patronen van M / M fenotype marker co-expressie kan worden beoordeeld door driedimensionale confocale beeldvorming in het ischemische gebied. Afbeeldingen kunnen worden verkregen over een bepaald volume (10 urn z-as en een 0,23 urn stapgrootte, corresponderend met een 180 x 135 x 10 micrometer volume) met een sequentiële scan modus doorbloeding te minimaliseren en golflengte overlapping te vermijden. De beelden worden dan verwerkt tot driedimensionale renderings verkrijgen volgens Imaris software. Solid van drie dimensionale renderings maakt de definitie van markerexpressie in clusters van cellen. We zien dat M / M hebben de mogelijkheid om te differentiëren naar een veelheid van fenotypes, afhankelijk van de locatie van de laesie en time na een blessure.
Introduction
Na een acuut hersenletsel, worden microglia snel geactiveerd en ondergaan dramatische morfologische en fenotypische veranderingen 1-3. Deze intrinsieke reactie wordt geassocieerd met de aanwerving van bloed geboren macrofagen, die migreren naar de verwonde hersenen parenchym 4,5. De rol van microglia en macrofagen die antigeen zijn niet te onderscheiden (hierna te noemen M / M) in hersenletsel is nog steeds gedebatteerd. Een toenemend aantal studies blijkt dat, overeenkomstig hetgeen beschreven perifere macrofagen en microglia hersenen geworven macrofagen kunnen verschillende fenotypes die extremen overeen met klassieke pro-inflammatoire toxisch (M1) of anti-inflammatoire beschermende (M2) fenotype aannemen. De verschillende activatie staten, waaronder uitscheiding van pro-of anti-inflammatoire factoren, neurotrofe afgifte van moleculen en lysosomale activiteit worden gekenmerkt door een specifiek patroon van fenotypische merkers, waarvan de expressie afhankelijk is van de temporeleontwikkeling van de omgeving. De karakterisatie van deze M / M fenotypes in de verwonde hersenen is nog steeds schaars. We gebruikten een gevestigde muizenmodel van pMCAo naar M / M expressie en evolutie na een beroerte te analyseren. Immunofluorescentie gebaseerde protocollen hier gepresenteerd gericht op het verkrijgen van inzicht in het optreden van de specifieke M / M fenotype markers, hun lokalisatie en cellulaire co-expressie in het ischemische gebied. We onderzochten een paar moleculen gekoppeld aan verschillende activering staat of fenotype, namelijk CD11b, een oppervlakte marker door leukocyten en een veel gebruikte marker van M / M activering / recruitment 6-8 uitgedrukt, CD68 een marker van lysosomen 6,7 en Ym1 een secretoire eiwit door alternatief geactiveerde (M2) macrofagen tot expressie gebracht en gekoppeld aan herstel en functieherstel 9-10.
Wanneer twee markers worden uitgedrukt door dezelfde cel, maar in verschillende subcellulaire compartimenten kan colocalization alleen veel inf nietormative. In dit geval kan de analyse van co-expressie worden uitgevoerd door een enkele bovenaanzicht en driedimensionale weergaven. We hier een protocol beschrijven aan een grondige driedimensionale analyse van de marker co-expressie te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We present here immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate localization and co-expression of M/M phenotype markers into the ischemic area (for a more detailed analysis see ref 6). This method combines specific staining of relevant marker of M/M activation with three-dimensional confocal imaging. The fine tuning of antibodies, serum and fluorconjugated working dilutions allows optimal signal to noise ratio of the investigated m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stefano Fumagalli is a fellow of the Monzino Foundation.
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
- Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
- Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
- Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
- Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
- Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).
