Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury
Summary
Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.
Abstract
Depois de acidente vascular cerebral microglia / macrófagos (M / M) sofrer ativação rápida, com alterações morfológicas e fenotípicas dramáticas que incluem expressão de antígenos de superfície novas e produção de mediadores que se formam e mantêm a resposta inflamatória. Algumas evidências indicam que M / M são células altamente plástico que pode assumir anti-inflamatória (M2) de activação pró-inflamatória (M1) ou alternativo clássico após lesão cerebral aguda. No entanto, uma caracterização completa de M / M expressão do marcador fenótipo, sua co-localização e evolução temporal no cérebro ferido ainda está desaparecida.
Protocolos de coloração por imunofluorescência especificamente marcadores relevantes de activação M / M pode ser realizada no cérebro isquémico. Apresentamos aqui os protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar o padrão de localização e de co-expressão de marcadores fenotípicos M / M, comoCD11b, CD68, Ym1, no modelo de rato de isquemia focal induzida por oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO). Análise bidimensional da área manchada revela que cada marcador é associado a uma morfologia M / M definido e tem uma dada localização na lesão isquémica. Padrões de M / M fenótipo marcador co-expressão pode ser avaliada por imagem confocal tridimensional na área isquémica. As imagens podem ser adquiridos ao longo de um volume definido (10 m z-eixo e um tamanho de 0,23 mM passo, o que corresponde a um volume de 180 x 135 x 10 mm) com um modo de varrimento sequencial para minimizar os efeitos de passagem de purga e de evitar a sobreposição de comprimento de onda. As imagens são, então, processado para obter representações tridimensionais, por meio de software Imaris. Visão sólida de três representações tridimensionais permite a definição de expressão do marcador em grupos de células. Nós mostramos que M / M têm a capacidade de se diferenciar para uma multiplicidade de fenótipos, dependendo da localização do local da lesão e time após a lesão.
Introduction
Após lesão cerebral aguda, microglia são rapidamente ativadas e passam por morfológica dramática e fenotípica muda 1-3. Esta resposta intrínseca está associada ao recrutamento de macrófagos nascido de sangue que migram para o parênquima cerebral 4,5 feridos. O papel da microglia e macrófagos que não são antigenicamente distintos (doravante referido como M / M) em lesão cerebral ainda é debatido. Um número crescente de estudos indicam que, à semelhança do que descrito para macrófagos periféricos, microglia e cérebro recrutados macrófagos pode assumir diferentes fenótipos cujos extremos correspondem ao clássico tóxico pró-inflamatória (M1) ou de protecção (M2) fenótipo anti-inflamatório. Os diferentes estados de activação, incluindo a secreção de factores pro-ou anti-inflamatórios, a libertação de moléculas neurotróficas e actividade lisossomal são caracterizadas por um padrão específico de marcadores fenotípicos, cuja expressão depende da temporaisevolução do ambiente circundante. A caracterização destes fenótipos M / M no cérebro feridos ainda é escasso. Nós usamos um modelo murino bem estabelecida de pMCAo para analisar a expressão M / M e evolução após o AVC. Protocolos de imunofluorescência base aqui apresentados visam a obtenção de uma visão sobre o aparecimento de marcadores específicos M / M fenótipo, sua localização e co-expressão celular na área isquêmica. Nós investigamos algumas moléculas associadas a diferentes estado de ativação ou fenótipo, ou seja, CD11b, um marcador de superfície expressa por leucócitos e um marcador amplamente utilizado de M / M ativação / recrutamento 6-8, CD68 um marcador de lisossomos 6,7 e Ym1 uma secreção proteína expressa pelo alternativamente ativados (M2) e macrófagos associados a recuperação e restauração da função 9-10.
Quando dois marcadores são expressos pela mesma célula, mas em diferentes compartimentos subcelulares, colocalização si só pode não ser tanto informative. Neste caso, a análise de co-expressão pode ser realizada utilizando único plano e vista por representações tridimensionais. Nós aqui descrevemos um protocolo para obter uma análise do marcador co-expressão completa tridimensional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar a localização e co-expressão de marcadores do fenótipo M / M para a área isquêmica (para uma análise mais detalhada, ver ref 6). Este método combina a coloração específica de marcador relevante de activação M / M e um imagem confocal tridimensional. O ajuste fino de anticorpos no soro, e fluorconjugated diluições de trabalho permite melhor sinal-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stefano Fumagalli é um companheiro da Fundação Monzino.
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
- Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
- Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
- Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
- Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
- Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).
