Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות
Summary
תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.
Abstract
תאי Neuroprogenitor (NPCs) מבודדים מהמוח העוברי האנושי הורחבו בתנאי שגשוג בנוכחות גורם אפידרמיס צמיחה (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) כדי לספק שפע של תאים. NPCs הובדלו בנוכחות שילוב חדש של גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורם במוח (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) וחומצה רטינואית על מנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר כדי להשיג נוירון עשירה בתרבויות. NPCs גם הובדלו בהעדר neurotrophins, DBC וחומצה רטינואית ובנוכחותו של גורם נוירוטרופי הריסים (CNTF) להניב תרבויות astrocyte עשיר. NPCs המובחן התאפיינו מכתים immunofluorescence לפנל של סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43. חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) וSTAT3, סמני astrocyte, התגלו ב10-15% מNPCs המובחן. כדי להקל עלאפיון מולקולרי תאים מסוג מסוים, microdissection ללכוד לייזר בוצע לבודד את תאי עצב בתרבית על naphthalate פוליאתילן שקופיות קרום (PEN). השיטות שתוארו במחקר זה מספקים כלים רבי ערך כדי לקדם את ההבנה של המנגנון המולקולרי של ניוון מוחיים שלנו.
Introduction
נוירוגנזה חיים ארוכים ידועה להתרחש באזור subventricular של החדרים לרוחב ובשכבת subgranular של gyrus משוננת של המוח של היונקים הבוגרים 1. תאי Neuroprogenitor (NPCs) שמקורם באזורים אלה הם תאי multipotent שיכול להתמיין לתאי עצב, האסטרוציטים וoligodendrocytes 2. NPCs יצרו עניין בשל הפוטנציאל שלהם להיות מושתלים בחולים עם הפרעות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) 3. מחקרים עם NPCs יש בדרך כלל מתמקדים בזווית ההשתלה הזה, אבל את הפוטנציאל של תאי עצב שמקורם בNPC כמודל תרבית תאים כדי לקבוע את המנגנון של ניוון מוחיים לא נוצל במלואו. מחקרים קודמים המשמשים בדרך כלל נוירונים לאחר mitotic בודדו מרקמות המוח מכרסם אשר צריכים להיות מבודדים עבור כל ניסוי כפי שהם לאחידוש עצמי. למרות שניתן להרחיב שורות תאי נוירובלסטומה האדם כולל SH-SY5Y ותאי SK-N-MC, אין להם את המאפיינים של נוירונים עיקרי. NPCs אדם, לעומת זאת, מציע גם יתרונות כי הם יכולים להיות מורחבים למעברים מרובים ויכולים להיות מובחן כדי לייצר אוכלוסיית תא עם המאפיינים של נוירונים העיקרי 4,5. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול בידול חדש כדי להשיג אוכלוסיית נוירון עשיר עקבית מNPCs זמין מסחרי מבודד מהמוח העוברי אנושי. מכיוון שתרבויות אלה מכילות אחוז קטן של תאי גליה, אנחנו צריכים שיטות נוספות כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של תאי עצב לאפיון מולקולרי. microdissection ללכוד לייזר (LCM) הוא טכניקה חדשנית שבו אוכלוסייה הומוגנית של תאים מקטע רקמה יכולה להיות שנתפסו באופן סלקטיבי לניתוח ביטוי גנים 6. המוח הוא רקמה הטרוגנית המורכבת של נוירונים, גליה וטאי הסלולרי האחרPES. LCM נעשה שימוש כדי לקבוע ביטוי נוירון הספציפי גן מנתח 7-10. אנחנו ביצענו בעבר LCM של נוירונים בהיפוקמפוס מחלקים לספירה (Tg2576) מוח עכבר כדי להראות ביטוי ירידה של חלבון מחייב אלמנט תגובת AMP המחזורי (CREB) וBDNF במיוחד בנוירונים בהיפוקמפוס 11. במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליכים להרחבת NPCs אדם, בידול עצבי, מכתים immunofluorescent עבור סמנים עצביים ו LCM עבור הבידוד של נוירונים בתרבית בשקופיות קרום PEN.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים במחקר זה מודל הנוירון עשיר בתרבית תאים בהתמיינות של תאי neuroprogenitor אנושיים עצמי חידוש ושיטה לבודד את אוכלוסייה טהורה של תאי עצב על ידי microdissection ללכוד לייזר. יש לנו השתמשתי בשילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לבידול עצבי של NPCs. DBC משמש להפעלת CREB, גורם שעתוק שמשפר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הצטיינות סקירה (NEUD-004-07F) מהמנהל הוותיקים (לSP).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer’s brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
