لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة
Summary
تم توسيع الخلايا neuroprogenitor الإنسان (الشخصيات) في ظل الظروف المتكاثرة. وقد تختلف الشخصيات في الثقافات الخلايا العصبية الغنية في وجود مزيج من neurotrophins. تم الكشف عن علامات العصبية التي كتبها المناعي تلطيخ. لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية، وقد تختلف الشخصيات في PEN الشرائح الغشاء وتم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري.
Abstract
تم توسيع الخلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) معزولة عن دماغ الجنين البشري في ظل ظروف التكاثري في وجود عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) لتوفير امدادات وفيرة من الخلايا. وقد تختلف الشخصيات في وجود تركيبة جديدة من عامل نمو الأعصاب (NGF)، المشتقة من عامل التغذية العصبية في الدماغ (BDNF)، dibutyryl المخيم (DBC) وحمض الريتينويك على أطباق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin للحصول على الخلايا العصبية الغنية الثقافات. وتختلف الشخصيات أيضا في غياب neurotrophins، DBC وحمض الريتينويك وبحضور الهدبية عامل التغذية العصبية (CNTF) لانتاج الثقافات نجمية الغنية. وتميزت الشخصيات المتباينة التي كتبها تلطيخ المناعي لوحة من علامات العصبية بما في ذلك NeuN، synapsin، أستيل، synaptophysin وGAP43. تم الكشف عن ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) وSTAT3، وعلامات نجمية، في 10-15٪ من الشخصيات المتباينة. لتسهيلخلية من نوع التوصيف الجزيئي محددة، تم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري لعزل الخلايا العصبية مثقف على البولي اثيلين naphthalate (PEN) الشرائح الغشاء. الطرق الموضحة في هذه الدراسة توفر أدوات قيمة لتعزيز فهمنا للآلية الجزيئية من تنكس عصبي.
Introduction
ومن المعروف الخلايا العصبية مدى الحياة لتحدث في المنطقة subventricular من البطينين الوحشي وفي طبقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من البالغين أدمغة الثدييات 1. خلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) التي تنشأ من هذه المناطق هي خلايا متعددة القدرات التي يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes 2. لقد ولدت الشخصيات الفائدة بسبب قدرتها على أن زرع في المرضى الذين يعانون من مختلف الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون والتصلب الوحشي الضموري والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) 3. الدراسات مع الشخصيات ركزت عموما على هذه الزاوية زرع لكن إمكانات الخلايا العصبية المشتقة من مجلس الشعب كنموذج زراعة الخلايا لتحديد آلية تنكس عصبي لم تستغل بالكامل. وقد استخدمت الدراسات السابقة عموما الخلايا العصبية بعد الإنقسامية المعزولة من أنسجة الدماغ القوارض والتي تحتاج إلى أن تكون معزولة عن كل تجربة لأنها ليستتجديد الذات. على الرغم من خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك SH-SY5Y والخلايا SK-N-MC يمكن توسيعها، لم يكن لديهم خصائص الخلايا العصبية الأولية. الشخصيات البشرية، من ناحية أخرى، تقدم كل المزايا لأنها يمكن توسيعها لفقرات متعددة ويمكن أن تكون متباينة لتوليد السكان الخلية مع خصائص الخلايا العصبية الأولية 4،5. في الدراسة الحالية، ونحن تصف بروتوكول التمايز جديدة للحصول على السكان الخلايا العصبية الغنية متسقة من الشخصيات المتاحة تجاريا معزولة عن دماغ الجنين البشري. لأن هذه الثقافات لا تحتوي على نسبة صغيرة من الخلايا الدبقية، ونحن بحاجة الى طرق إضافية لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية لتوصيف الجزيئي. القبض على الليزر تسليخ مجهري (LCM) هو أسلوب الرواية التي يبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا من قسم الأنسجة يمكن ملاحظتها بشكل انتقائي لتحليل التعبير الجيني 6. الدماغ هو نسيج غير متجانس يتكون من الخلايا العصبية، الدبقية وغيرها تاي الخليةعبوة. وقد استخدم LCM لتحديد الخلايا العصبية محددة التعبير الجيني يحلل 7-10. وقد أجرينا في السابق LCM من الخلايا العصبية قرن آمون من م (Tg2576) أقسام مخ الفأر لإظهار التعبير انخفض من دوري عنصر استجابة AMP البروتين ملزمة (CREB) وعامل التغذية العصبية تحديدا في الخلايا العصبية الحصين 11. في هذه الدراسة، ونحن تصف إجراءات لتوسيع الشخصيات البشرية، وتمايز الخلايا العصبية، وتلطيخ مناعي للعلامات العصبية وLCM لعزل الخلايا العصبية مثقف على الشرائح PEN الغشاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا في هذه الدراسة نموذجا ثقافة الخلية العصبية غنية عن طريق تمايز الخلايا neuroprogenitor الإنسان تجديد الذات وطريقة لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية بواسطة الليزر التقاط تسليخ مجهري. وقد استخدمنا مزيج من نيسان الخليج، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك للتماي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة الاستحقاق مراجعة (NEUD-004-07F) من إدارة المحاربين القدامى (ليرة سورية).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer’s brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
