Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Neurogénese longo da vida, é conhecido por ocorrer na zona subventricular dos ventrículos laterais e na camada subgranular do giro dentado do cérebro de mamíferos adultos ^1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originam a partir destas regiões são células multipotentes que podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos ^2. NPCs gerado interesse devido ao seu potencial para ser transplantadas em pacientes com várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) ^3. Estudos com NPCs geralmente centrada sobre este ângulo de transplante, mas o potencial de neurónios NPC-derivados como um modelo de cultura de células para determinar o mecanismo de neurodegeneração não foi totalmente explorada. Estudos anteriores têm geralmente utilizados os neurónios pós-mitóticos, isolado a partir de tecidos do cérebro de roedores, que devem ser isoladas para cada experiência em que não sejamauto-renovação. Embora as linhas celulares de neuroblastoma humano, incluindo SH-SY5Y e células SK-N-MC pode ser expandido, elas não têm as características de neurónios primários. NPCs humanos, por outro lado, oferecem vantagens porque eles podem ser expandidos para várias passagens e podem ser diferenciados para gerar uma população de células com as características primárias de neurónios ^4,5. No presente estudo, descrevemos um novo protocolo de diferenciação para se obter uma população rica em neurônio consistente de NPCs disponíveis comercialmente isoladas de cérebro fetal humano. Porque essas culturas contêm uma pequena porcentagem de células gliais, precisamos de métodos adicionais para isolar uma população pura de neurônios para caracterização molecular. Captura laser microdissecção (LCM) é um nova técnica pela qual uma população homogénea de células a partir de uma secção de tecido podem ser capturadas selectivamente para análise da expressão do gene ^6. O cérebro é um tecido heterogêneo composto por neurônios, células gliais e outros ty celularpes. LCM foi utilizado para determinar a expressão de genes específicos de neurónios analisa ^7-10. Temos realizado anteriormente LCM de neurônios do hipocampo de AD (Tg2576) seções do cérebro do rato para mostrar a diminuição da expressão de proteína de ligação elemento de resposta ao AMP cíclico (CREB) e BDNF especificamente nos neurônios do hipocampo ^11. No presente estudo, descrevemos os procedimentos para a expansão dos NPCs humanos, a diferenciação neuronal, coloração de imunofluorescência para marcadores neuronais e LCM para o isolamento de neurônios cultivados em PEN lâminas de membrana.