Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре
Summary
Клетки человека нейрональные (NPC) были расширены под пролиферирующих условиях. НПС дифференцировались в нейронных богатых культур в присутствии комбинации нейротропинов. Нейронные маркеры были обнаружены иммунофлуоресцентного окрашивания. Чтобы изолировать чистую популяцию нейронов, НПС были дифференцированы на PEN мембранных горками и лазерная захвата микродиссекции была выполнена.
Abstract
Нейрональные клетки-предшественники (НПК), выделенные из головного мозга плода человека были расширены при пролиферативных условиях в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), чтобы обеспечить избытке клеток. НПС дифференцировались в присутствии новой комбинации фактора роста нервов (NGF), головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), дибутирил цАМФ (DBC) и ретиноевой кислоты на чашки, покрытые поли-L-лизин и мыши ламинин, чтобы получить нейрон богатых культур. НПС также дифференцированы в отсутствие нейротропинов, DBC и ретиноевой кислоты и в присутствии цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), получая астроцитов богатых культур. Дифференцированные НПС характеризовались иммунофлюоресцентного окрашивания для панели нейронных маркеров, включая NeuN, synapsin, ацетилхолинэстеразы, синаптофизина и GAP43. Глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и STAT3, астроцитов маркеры, были обнаружены в 10-15% дифференцированных NPC. Для облегчениякамерного типа конкретных молекулярная характеристика, лазерная захвата микродиссекции было проведено с целью изолировать нейроны культивировали на полиэтиленнафталата (PEN) мембранные горки. Методы, описанные в данном исследовании ценный инструмент для продвижения нашего понимания молекулярного механизма нейродегенерацией.
Introduction
Пожизненное нейрогенез как известно, происходит в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и в субгранулярной слоем зубчатой извилине взрослом мозге млекопитающих 1. Нейрональные клетки (NPC), которые происходят из этих регионов мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты 2. НПС породили интерес из-за их потенциала для пересадки у больных с различными нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, инсульт и болезни Альцгеймера (БА) 3. Исследования с НПС в целом направлены на этого угла трансплантации но потенциал NPC-производных нейронов в качестве модели клеточной культуры, чтобы определить механизм нейродегенерацией не в полной мере. Предыдущие исследования обычно используется постмитотические нейроны, выделенные из головного мозга грызунов тканей, которые должны быть выделены для каждого эксперимента, поскольку они несамообновлению. Хотя человеческая нейробластома клеточные линии, включая SH-SY5Y и SK-N-MC клетки могут быть расширены, они не имеют характеристики первичных нейронов. Человеческие НПС, с другой стороны, предлагают как преимущества, так как они могут быть расширены для многократного прохода и могут быть дифференцированы, чтобы генерировать клеточной популяции с характеристиками первичных нейронов 4,5. В текущем исследовании, мы описываем новый протокол дифференциации получить последовательную нейронов богатых населения из коммерчески доступных НПС, выделенных из мозга человеческого плода. Поскольку эти культуры действительно содержат небольшой процент клеток глии, нужно использовать дополнительные методы, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов для молекулярных характеристик. Лазерный захват микродиссекции (LCM) представляет собой новый метод, с помощью которого гомогенной популяции клеток из раздела тканей могут быть селективно захватывается для анализа экспрессии генов 6. Мозг представляет собой гетерогенную ткань, состоящая из нейронов, глии и другие мобильные типес. LCM была использована для определения экспрессии генов нейронов конкретных анализов 7-10. Ранее мы уже выполняется НОК нейронов гиппокампа от AD (Tg2576) разделов мозга мыши, чтобы показать снижение экспрессии циклического элемента AMP ответ связывающего белка (CREB) и BDNF в частности, в нейронах гиппокампа 11. В настоящем исследовании мы описываем процедуры для расширения человеческих НПС, дифференцировки нейронов, иммунофлуоресцентного окрашивания нервных маркеров и LCM для выделения нейронов культивируемых на PEN мембранных слайдов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем в этом исследовании нейрона богатых модель клеточной культуры по дифференциации самообновляющихся нейрональных клеток человека и способ, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов лазерным захвата микродиссекции. Мы использовали комбинацию NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кисл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом заслуги обзору (NEUD-004-07F) из делам ветеранов (в СП).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer’s brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
