A<em> Caenorhabditis elegans</em> Sistema modello per Amylopathy Studio
Summary
Descriviamo i metodi per studiare aspetti della amylopathies nel verme<em> C. elegans</em>. Mostriamo come costruire i vermi che esprimono Ap umano<sub> 42</sub> Nei neuroni e come testare la loro funzione in saggi comportamentali. Mostriamo ulteriormente come ottenere colture neuronali primarie che possono essere utilizzati per il test farmacologico.
Abstract
Amylopathy è un termine che descrive la sintesi e l'accumulo anomalo di beta amiloide (Ap) nei tessuti con tempo. Ap è un segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) e si trova nella demenza a corpi di Lewy, miosite da corpi inclusi e angiopatia amiloide cerebrale 1-4. Amylopathies progressivamente si sviluppano con il tempo. Per questo motivo gli organismi semplici con brevi durate di vita possono aiutare a chiarire gli aspetti molecolari di queste condizioni. Qui, descriviamo protocolli sperimentali per lo studio neurodegenerazione Ap-mediata utilizzando verme Caenorhabditis elegans. Così, costruiamo vermi transgenici iniettando il DNA codificante Ap umano 42 nelle gonadi sinciziale di ermafroditi adulti. Linee trasformanti sono stabilizzate da una integrazione mutagenesi indotta. Nematodi sono sincronizzati età raccogliendo e seminando loro uova. La funzione dei neuroni che esprimono Ap 42 viene testato in saggi comportamentali opportune (chemiotassi assays). Colture primarie neuronali ottenute da embrioni vengono utilizzati per integrare i dati comportamentali e per testare gli effetti neuroprotettivi di composti anti-apoptotici.
Introduction
Beta amiloide (Ap) è un peptide di 36-43 aminoacidi che si forma a seguito della scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) per β e γ secretasi 1. Il γ secretasi elabora l'estremità C-terminale del peptide Ap ed è responsabile per le sue lunghezze variabili 5. Le forme più comuni di Ap sono Ap 40 Ap e 42, quest'ultimo essendo più comunemente associato a condizioni patologiche come 5 AD. Ad alte concentrazioni Ap forma β-sheets che aggregano a formare fibrille amiloidi 6. Depositi di fibrille sono il componente principale delle placche senili che circondano i neuroni. Entrambe le targhe e diffusibili, oligomeri Ap non placca, si pensa di costituire le forme patogene sottostanti Ap.
Studio di laboratorio di amylopathies neuronali è complicata dal fatto che queste condizioni progresso con il tempo. Pertanto, è important di sviluppare modelli animali geneticamente trattabili-complementari a topi-con vita breve. Questi modelli possono essere utilizzati per spiegare aspetti specifici di amylopathies-tipicamente cellulare e molecolare e in virtù della loro semplicità, aiutare a catturare l'essenza del problema. Il verme Caenorhabditis elegans cascate è questa categoria. Ha una durata di vita breve, ~ 20 giorni e in aggiunta i processi cellulari di base tra cui regolazione dell'espressione genica, traffico di proteine, connettività neuronale, sinaptogenesi, segnalazione cellulare e la morte sono simili ai mammiferi 7. Le caratteristiche uniche del worm includono la genetica potenti e la mancanza di un sistema di vasi, che permette di studiare i danni neuronali indipendentemente da danno vascolare. D'altra parte, la mancanza di un cervello limita l'uso di C. elegans per studiare molti aspetti della neurodegenerazione. Inoltre, la riproduzione e identificazione di distribuzioni anatomiche delle lesioni non possono essere eseguite in questo organismo. Altro limitezioni comprendono la difficoltà di valutare sia le differenze nei profili di espressione genica e di valore di un comportamento complesso e funzione di memoria. Qui si descrivono i metodi per generare C. elegans modelli di amylopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un approccio combinato, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari delle amylopathies utilizzando C. elegans. I vantaggi di questo approccio includono:. 1) basso costo C.elegans è mantenuta in normali Petri seminato con batteri, a temperatura ambiente. 2) genetica potente. Animali transgenici possono essere ottenuti in pochi mesi e alla vasta gamma di sequenze promotore è disponibile per guidare l'espressione del gene desiderato in neuroni specifici. 3), ben caratterizzato, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
References
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