<em> Elegans Caenorhabditis</em> מערכת מודל לחקר Amylopathy
Summary
אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies בתולעת<em> ג elegans</em>. אנחנו מראים כיצד לבנות תולעים מבטאים Aβ האנושי<sub> 42</sub> בתאי עצב וכיצד לבדוק את תפקודם במבחני התנהגות. בנוסף, אנו מראים כיצד להשיג תרבויות עצביות עיקריות שיכול לשמש לבדיקה תרופתית.
Abstract
Amylopathy הוא מונח המתאר את הסינתזה חריגה והצטברות של בטא עמילואיד (Aβ) ברקמות עם זמן. Aβ הוא סימן היכר של מחלת אלצהיימר (AD), והוא נמצא בדמנציה לוי גוף, שררת גוף הכללה וangiopathy עמילואיד המוחי 1-4. Amylopathies לפתח בהדרגה עם זמן. מסיבה זו אורגניזמים פשוטים עם תוחלת חיים קצרות עשויים לעזור להבהיר היבטים מולקולריים של תנאים אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי ללמוד ניוון מוחיים Aβ בתיווך באמצעות elegans Caenorhabditis התולעת. לפיכך, אנו בונים תולעים מהונדסים על ידי הזרקת Aβ אנושי קידוד ה-DNA 42 לבלוטות מין סינסיציאלי של הרמפרודיטים בוגרים. קווי Transformant הם התייצבו על ידי שילוב מושרה mutagenesis. נמטודות הם גיל מסונכרן על ידי איסוף וזריעת הביצים שלהם. התפקוד של נוירונים המבטאים Aβ 42 נבדק במבחני התנהגות מתאימים (assay chemotaxisים). תרבויות עצביות העיקריות שמקורם בעוברים משמשות כדי להשלים נתונים התנהגותיים וכדי לבדוק את ההשפעות של neuroprotective תרכובות אנטי אפופטוטיים.
Introduction
בטא עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד של 36-43 חומצות אמינו שתקום לאחר מחשוף רציף של החלבון המקדים עמילואיד (APP) ועל ידי β secretases 1 γ. Secretase γ מעבד סוף C-המסוף של הפפטיד Aβ והוא אחראי עליה אורכים משתנים 5. הצורות הנפוצות ביותר של Aβ הן 40 Aβ וAβ 42, האחרון להיות קשור יותר בכינוי לתנאים פתולוגיים כגון 5 לספירה. בריכוזי Aβ טופס β גיליונות גבוהים שמצרף ליצירת סיבי עמילואיד 6. פיקדונות סיבים הם המרכיב העיקרי של פלאק סנילי סביב הנוירונים. שני לוחות ו oligomers Aβ diffusible, לא פלאק, הם חשבו מהווים צורות פתוגניים הבסיסיות של Aβ.
מעבדת מחקר של amylopathies העצבי הוא מסובך בשל העובדה כי תנאים אלה התקדמות עם זמן. לכן, זה importanלא לפתח חיה צייתנית גנטי דגמים-משלים לעכברים עם תוחלת חיים קצרה. מודלים אלה יכולים לשמש כדי להבהיר היבטים ספציפיים של amylopathies-בדרך כלל סלולרי ו, מולקולרי ומכוח הפשטות שלהם לעזור כדי ללכוד את המהות של הבעיה. תולעת Caenorhabditis elegans הנפילות היא קטגוריה זו. יש לו תוחלת חיים קצרה, ~ 20 ימים ובנוסף תהליכים תאיים בסיסיים, כולל רגולציה של ביטוי גנים, סחר בחלבון, קישוריות עצבית, synaptogenesis, איתות תא, ומותו הם דומים ל7 יונקים. תכונות ייחודיות של התולעת כוללות גנטיקה וחוסר מערכת כלי, המאפשר ללמוד באופן עצמאי נזק עצבי של נזק בכלי הדם רבי עוצמה. מצד השני, חוסר מוח מגביל את השימוש בג elegans ללימוד היבטים רבים של ניוון מוחיים. בנוסף, לא ניתן לבצע העתקה וזיהוי של הפצות אנטומיים של נגעים באורגניזם זה. מגבלה אחרתations כולל קושי להעריך את שני ההבדלים בביטוי גן פרופילים וירידת הערך של התנהגות מורכבת ותפקוד זיכרון. כאן אנו מתארים שיטות להפקת ג מודלים של amylopathies elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים גישה משולבת, ללמוד היבטים תאיים ומולקולריים של amylopathies באמצעות ג elegans. היתרונות של גישה זו כוללים: 1.) בעלות הנמוכה C.elegans נשמר בצלחת פטרי עם חיידקים נורמלי זורעים, בטמפרטורת חדר. 2) גנטיקה עוצמה. ניתן להשיג בבעלי חיים מהונדסים בכמה חודשים, ומגוון ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
References
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
