A<em> انواع معينة ايليجانس</em> النظام النموذجي للدراسات Amylopathy
Summary
نحن تصف أساليب لدراسة جوانب amylopathies في الدودة<em> C. ايليجانس</em>. وتبين لنا كيفية بناء الديدان معربا عن Aβ الإنسان<sub> 42</sub> في الخلايا العصبية وكيفية اختبار وظيفتها في المقايسات السلوكية. وتبين لنا كيفية الحصول على مزيد من الثقافات العصبية الأولية التي يمكن استخدامها لاختبار الدوائية.
Abstract
Amylopathy هو المصطلح الذي يصف تركيب غير طبيعي وتراكم اميلويد بيتا (Aβ) في الأنسجة مع مرور الوقت. Aβ هو السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD)، ويوجد في الجسم ليوي الخرف، إدراج التهاب العضل في الجسم واعتلال الأوعية الدماغية اميلويد 1-4. Amylopathies تطوير تدريجيا مع مرور الوقت. لهذا السبب الكائنات بسيطة مع أعمار قصيرة قد يساعد في توضيح الجوانب الجزيئية لهذه الشروط. هنا، نحن تصف البروتوكولات التجريبية لدراسة تنكس عصبي Aβ بوساطة استخدام انواع معينة ايليجانس دودة. وهكذا، ونحن بناء الديدان المعدلة وراثيا عن طريق حقن الحمض النووي الترميز Aβ الإنسان 42 إلى الغدد التناسلية المخلوي من المنحرفين الكبار. واستقرت خطوط المحولة من قبل التكامل الطفرات التي يسببها. الديدان الخيطية هي سن متزامنة من خلال جمع وبذر بيضها. يتم اختبار وظيفة الخلايا العصبية معربا عن Aβ 42 في المقايسات السلوكية المناسب (الكيميائي مقايسةق). وتستخدم الثقافات العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من الأجنة لاستكمال البيانات السلوكية واختبار آثار اعصاب من المركبات المضادة للأفكارك.
Introduction
بيتا اميلويد (Aβ) هي الببتيد من 36-43 الأحماض الأمينية التي يتم تشكيلها بعد انشقاق متتابعة من البروتين اميلويد السلائف (APP) بواسطة β γ وsecretases 1. يعالج secretase γ نهاية C-محطة من الببتيد Aβ، وهي مسؤولة عن أطوال متغير ل 5. الأشكال الأكثر شيوعا من Aβ هي Aβ 40 و 42 Aβ، وهذا الأخير مرتبطا أكثر شيوعا لظروف مرضية مثل 5 م. بتركيزات عالية Aβ شكل β-الأوراق التي تتجمع لتشكيل الألياف اميلويد 6. الودائع الألياف هي المكون الرئيسي لويحات خرف المحيطة الخلايا العصبية. ويعتقد أن كلا ويحات وإنتشاري، الأوليغومرات Aβ غير لوحة، لتشكل أشكال المسببة للأمراض الكامنة وراء Aβ.
معقد دراسة مختبرية من amylopathies العصبية من حقيقة أن هذه الشروط التقدم مع مرور الوقت. وبالتالي، فمن مهمر لتطوير الحيوانية لين العريكة وراثيا نماذج تكميلية لالفئران مع قصيرة العمر. هذه النماذج يمكن استخدامها لتوضيح جوانب محددة من amylopathies-عادة الخلوية والجزيئية وبحكم بساطتها، وتساعد على التقاط جوهر المشكلة. الدودة انواع معينة ايليجانس السقوط هو هذه الفئة. لديها فترة حياة قصيرة، ~ 20 يوما وبالإضافة العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تنظيم التعبير الجيني، والاتجار البروتين، والربط العصبية synaptogenesis، و، إشارة الخلية، والموت تشبه الثدييات 7. ميزات فريدة من الدودة تشمل الوراثة قوية وعدم وجود نظام السفينة، والتي تمكن لدراسة الأضرار العصبية بشكل مستقل عن تلف الأوعية الدموية. من ناحية أخرى، فإن عدم وجود الدماغ يحد من استخدام C. ايليجانس لدراسة جوانب كثيرة من التنكس العصبي. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن استنساخ وتحديد التوزيعات التشريحية للآفات أن يؤديها في هذا الحي. الحد الأخرىوتشمل ations صعوبة تقييم كل الاختلافات في ملامح التعبير الجيني وضعف السلوك معقدة وظيفة الذاكرة. نحن هنا وصف الطرق لتوليد C. ايليجانس نماذج من amylopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف نهج موحد، لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية من amylopathies باستخدام C. ايليجانس. مزايا هذا النهج ما يلي: 1) يتم الاحتفاظ منخفضة التكلفة C.elegans في طبق بتري العادية المصنف مع البكتيريا، في درجة حرارة الغرفة. 2) علم الوراثة قوية. ويمكن الحصول على الحيوانات ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
References
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
