Een<em> Caenorhabditis elegans</em> Model Systeem voor Amylopathy Study
Summary
Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te bestuderen<em> C. elegans</em>. We laten zien hoe je wormen die humaan Aß construeren<sub> 42</sub> In neuronen en hoe ze hun functie in de gedrags-assays te testen. We tonen verder hoe primaire neuronale kweken die worden gebruikt voor farmacologische proeven verkrijgen.
Abstract
Amylopathy is een term die abnormale synthese en accumulatie van amyloïde beta (Aß) in weefsels met de tijd beschrijft. AB is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD) en is gevonden in Lewy body dementie, inclusion body myositis en cerebrale amyloïde angiopathie 1-4. Amylopathies geleidelijk ontwikkelen met de tijd. Daarom eenvoudige organismen met een korte levensduur kan helpen om moleculaire aspecten van deze voorwaarden helderen. Hier beschrijven we de experimentele protocollen aan Aß-gemedieerde neurodegeneratie met de worm Caenorhabditis elegans. Zo bouwen we transgene wormen door het injecteren van DNA dat codeert voor humaan Ap 42 in de syncytieel gonaden van volwassen hermafrodieten. Transformante lijnen worden gestabiliseerd door een mutagenese-geïnduceerde integratie. Nematoden zijn leeftijd gesynchroniseerd door het verzamelen en zaaien hun eieren. De functie van neuronen die Aß42 worden getest opportuun gedrag assays (chemotaxis assays). Primaire neuronale culturen afkomstig van embryo's worden gebruikt om gedrags-gegevens aan te vullen en aan de neuroprotectieve effecten van anti-apoptotische verbindingen te testen.
Introduction
Amyloid beta (Aß) is een peptide van 36-43 aminozuren dat wordt gevormd na klieving van het amyloïd precursor eiwit (APP) door β en γ secretasen 1. Het γ secretase verwerkt de C-terminale einde van het Aß peptide en is verantwoordelijk voor de variabele lengte 5. De meest voorkomende vormen van Aß zijn Aß Aß 40 en 42, welke laatste vaker geassocieerd met pathologische aandoeningen zoals AD 5. Bij hoge concentraties Aß vorm β-sheets die aggregeren tot amyloid fibrillen vormen 6. Fibrillen afzettingen zijn de belangrijkste component van seniele plaques omringende neuronen. Zowel plaques en diffundeerbaar, niet-plaque Aß oligomeren, wordt gedacht dat de onderliggende pathogene vormen van Ap vormen.
Laboratoriumonderzoek van neuronale amylopathies wordt gecompliceerd door het feit dat deze voorwaarden vooruitgang tijd. Daarom is important om genetisch handelbaar dier te ontwikkelen modellen-complementair aan muizen-met een korte levensduur. Deze modellen kunnen worden gebruikt om specifieke aspecten van amylopathies-typisch cellulaire en moleculaire-en uit hoofde van hun eenvoud, helpen om de essentie van het probleem vast te leggen toe te lichten. De worm Caenorhabditis elegans falls is deze categorie. Het heeft een korte levensduur, ~ 20 dagen en bovendien fundamentele cellulaire processen zoals regulatie van genexpressie, eiwit mensenhandel, neuronale connectiviteit, synaptogenese, cell signaling, en dood zijn vergelijkbaar met zoogdieren 7. Unieke eigenschappen van de worm zijn krachtige genetica en het ontbreken van een vatenstelsel, waardoor neuronale beschadiging onafhankelijk van vasculaire schade bestuderen. Anderzijds, het ontbreken van hersenen beperkt het gebruik van C. elegans te bestuderen van vele aspecten van neurodegeneratie. Bovendien kan de reproductie en identificatie van anatomische verdeling van laesies worden uitgevoerd in dit organisme. Andere limietties omvatten de moeilijkheid om zowel verschillen in genexpressie profielen en bijzondere waardevermindering van complex gedrag en geheugenfunctie beoordelen. Hier beschrijven we methoden genereren C. elegans modellen van amylopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een gecombineerde aanpak, om cellulaire en moleculaire aspecten van amylopathies behulp C. studeren elegans. De voordelen van deze benadering zijn: 1.) Goedkope C.elegans wordt gehandhaafd normale petrischaal geënt met bacteriën, bij kamertemperatuur. 2) Krachtige genetica. Transgene dieren kunnen worden verkregen maanden en gemak promotorsequenties is om expressie van het gewenste gen in specifieke neuronen rijden. 3) Eenvoudig, goed gekarakteriseerde, zenuwstelsel. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
References
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
