JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Микроманипуляция экспрессии генов в головном мозге взрослых данио рерио Использование церебровентрикулярных Микроинъекции олигонуклеотиды Морфолино

Published: May 23, 2013
doi:
10.3791/50415
, , ,
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden,Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden

Summary

В этой статье мы демонстрируем метод манипуляции экспрессии генов в клетках желудочка у взрослых данио конечного мозга с использованием антисмысловых морфолино олигонуклеотидов. Мы представляем этот метод как эффективный и быстрый протокол, который может быть использован для функциональных исследований в головном мозге взрослых позвоночных.

Abstract

Манипуляция экспрессию генов в тканях, необходимые для выполнения функциональных исследований. В этой работе показано, церебровентрикулярных микроинъекции (CVMI) технику как средство для модуляции экспрессии генов в головном мозге взрослых данио. При использовании CVMI, вещества могут быть введены в церебровентрикулярных жидкости и тщательно распределенных вдоль оси рострокаудальных мозга. Мы особенно сосредоточены на использовании антисмысловых олигонуклеотидов морфолино, которые являются мощными инструментами для сбивание экспрессии генов в естественных условиях. В нашем методе, при нанесении, морфолиногруппу молекулы рассмотрен клетки, выстилающие поверхность желудочка. Эти клетки включают радиальные глиальные клетки, которые действуют как нейрогенный предшественников. Поэтому, сбивая экспрессии генов в клетки радиальной глии имеет первостепенное значение для анализа широкий резонанс нейрогенез у рыбок данио, а также дало бы представление о том, как позвоночные могли выдержать взрослого NeurogenESIS ответа. Такое понимание также поможет усилия для клинического применения в человеческих нейродегенеративных расстройств и центральной нервной системы регенерации. Таким образом, мы представляем церебровентрикулярных методом микроинъекции как быстрый и эффективный способ для изменения экспрессии генов и нейрогенезом ответ в переднем мозге взрослых данио. Мы также предоставляем советы по устранению неполадок и другую полезную информацию о том, как проводить процедуру CVMI.

Introduction

Взрослый нейрогенеза является общей чертой для позвоночных, однако степень его распространенности и эффективности зависит от филогении 1,2,3,4,5,6. Например, взрослый мозг млекопитающих содержат стволовых клеток регионах в значительной степени ограничены 7,8 переднего мозга, в то время как у рыбок данио костистых содержит шестнадцать различных стволовых клеток и связанных с ними областях нейрогенных зон во всей своей мозга 4,5,9,10. Эта вариация между млекопитающими и рыбок данио, возможно, отражает различия в механизмах поддержания стволовых клеток и нейрогенного потенциала клеток-предшественников. Пожизненное компетенции данио производить нейронов в головном мозге могут вызывать и клинические последствия как молекулярные механизмы, используемые мозгом данио можно было бы использовать для терапевтических применений для решения нейродегенеративных расстройств у людей.

Некоторые стволовые клетки зоны мозга взрослого человека данио были проанализированы и было показано, чтоклетки, выстилающие поверхность желудочка этих регионов служат клетки-предшественники 9,11-20. Подробный анализ в мозге данио, например, определены радиальные глиальные клетки, которые очерчивают желудочковой поверхности этой области мозга быть нейрогенный предшественников 19, 20. Это справедливо как для других регионов, например мозжечком и тектум, где расположен ventricularly-нейроэпителиальным клетки обеспечивают нейрогенное входного 16,21. С этой целью понимания молекулярных механизмов, регулирующих широкое нейрогенное компетентность в головном мозге взрослых данио требует манипуляций с экспрессии генов в клетки-предшественники.

Различные методы были описаны выше для модулирования функции гена в данио рерио. Они включают в себя генерацию условного трансгенных линий, экспрессирующих желаемый варианты одного белка, плазмиды на основе координационного инъекций, соединенный с электропорации или химической обработки. Ранее мы разработалиспособ введения различных веществ, включая морфолино олигонуклеотиды или белков в головном мозге взрослых данио использованием микроинъекции церебровентрикулярных как быстрый и эффективный способ модуляции функции гена в клетках желудочков переднего мозга взрослых данио 22. В наших исследований естественных морфолины использовались из-за их химии с участием молекул морфолино ковалентно связаны с аргинина богатый доставку пептидов, которые обеспечивают эффективную доставку в клетки интерес, без необходимости в дополнительных проницаемости, таких как электропорация 23. Это позволит тщательное нападения на нужную ткань после инъекции, как то, что мы наблюдали в мозге взрослых данио 22. Использование естественных морфолины, следовательно, превосходит уже существующие методы тканей, таких как электропорация или координационные инъекции ДНК молекул.

Здесь мы наглядно продемонстрировать, как мы выполнить эту операцию и обеспечитьшаг за шагом протокола. Начнем с объяснения приготовления смеси впрыска и рыбы, который будет введен, и перейти, демонстрируя, как устройства впрыска настроена. Мы предлагаем описание церебровентрикулярных метод инъекции, который включает создание разреза в черепа и инъекции морфолины использованием микроинъектор. Мы также подробно остановиться на критических точках, нужно быть осторожными во время всей процедуры, заявив, их оптимизации или устранению неисправностей.

Protocol

1. Приготовление инъекции смеси Использование естественных Morpholinos как клетки усвоить их более эффективно, чем обычные молекулы морфолиногруппу. См. информацию для производителя за более подробной информацией (Таблица 1: Реагенты и материалы). С помощью флуоресцентного красителя отслеживания (например CellTracker Красный CMTPX, Invitrogen) для визуализации достоверность инъекции. Этот краситель метаболизируется в клетке и становится флуоресцентный только в клетке после поглощения. Таким образом, этот шаг крайне важен для определения клеток, которые эффективно мишенью церебровентрикулярных микроинъекции. Подготовка фосфатно-солевом буфере (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ КН 2 РО 4, рН 7,4) для разбавления морфолино раствора. Если разбавление раствора морфолино, необходимо всегда использовать PBS. Подготовка 10 мкл инъекции смеси путем добавления 9 мкл раствора морфолино и 1 мкл йэлектронной клетки отслеживания краситель (разбавленный или неразбавленный запас концентрации раствора морфолино 500 мкМ Наши результаты предыдущих 22 показывают, что несколько различных доз морфолино -.. в диапазоне от 50 мкМ до 500 мкМ – приводят к различным уровням нокдаун от эффективного нокдауна гипоморфными фенотипа). 1 мкл раствора достаточно для инъекции в одно данио мозга. Хорошо перемешать и хранить при комнатной температуре до инъекции. 2. Приготовление инъекции Аппарат Подготовьте стекло инъекции капилляров с помощью иглы съемника. Используйте следующие параметры: стоимость отопления цикл: 463, потянув цикла значение: 230, Скорость: 1.5 сек, время: 75 мс. Включите источник давления и отрегулировать давление настройки до 50 фунтов на квадратный дюйм или 3,5 бара. Отрегулируйте микроинъектор настройки следующим образом: удерживать давление 20 фунтов на квадратный дюйм, извлечения давление 10 фунтов на квадратный дюйм, значение периода 2,5 и 100 мс диапазон стробирования. Повернутьна кольцевой осветитель и найдите кольцо на столике микроскопа. Поместить капиллярную держатель в соответствующее положение рядом с микроскопом. Вставьте стеклянный капилляр в держатель. Регулировка инъекции угол до 45 градусов. Привязка от кончика стеклянного капилляра с помощью тонкой конец пинцетом и калибровки давление на выходе из сопла. Это должно быть проверено путем погружения кончика иглы в воде рыбы и дает непрерывный импульс давления. Пузырьки воздуха, возникающих должна быть только одна строка, которая является показателем оптимального давления / размер отверстия. Пожалуйста, ознакомьтесь с видео для демонстрации этой калибровки. Загрузите стеклянный капилляр с раствор для инъекций без захвата пузырьков воздуха. Применение давления для удаления воздуха между кончиком стеклянного капилляра и загруженной инъекционного раствора. 3. Анестезия Подготовка исходного раствора анестетика (0,1% MESAB – этил-м-аминобензоата метансульфонаты). Отбор требуемого количества рыбы из танков в пластиковых клетках мыши или другой транспортный контейнер с достаточным количеством воды. Подготовьте обезболивания раствор в небольшую пластиковую коробку путем смешивания 200 мл воды рыба с 5 мл раствора анестетиков. Конечная концентрация анестетики: 0,0025% (об / об). Half-заполнить пластиковую чашку Петри с анестетиками. Используйте это блюдо для инъекций. Выдержите рыбу в анестетиков, пока рыба подчиняет. 4. Разрез и церебровентрикулярных Микроинъекция Снимите рыбу из окна с помощью рыболовной сети и поместить его в чашки Петри. Аккуратно прижмите рыбу с пинцетом и ориентировать голову таким образом, что она слегка наклоны вниз. Это будет способствовать разрез. Создайте небольшую щель на черепе использованием 30 размера колючей конце иглы. Используйте только кончик иглы и не проникают болееДостаточно в мозг, так как это может привести к повреждению ткани мозга и проявятся как кровотечение. Удерживайте рыбы и вставьте наконечник стеклянный капилляр через разрез сайта. Orient кончика стеклянного капилляра в направлении конечного мозга. Избегайте прикосновения к ткани головного мозга, так как это создает повреждение тканей, а также предотвращает дисперсию вводили раствор. Введите раствора. Жидкость диспергирует сразу после инъекции. 5. Восстановление и анализ точности выведения Снимите рыбу из установки инъекцию и поместить в пластиковую коробку с пресной водой рыбу. Разрешить восстановление. Повторно анестезировать рыбы с 0,0025% MESAB коротко и проверить рыбу под флуоресцентным микроскопом. Тщательное дисперсии красной флуоресценции является показателем широкое распределение закачиваемой жидкости. Положите рыбу обратно в пластиковой коробке. Подключите пластмассовом корпусе, тон циркуляционной системы для оксигенации рыбы и поддерживать в течение длительного периода времени. Использование рыбы желаемой цели, такие как поведенческий анализ или жертвовать животных в желаемое моменты времени после инъекции для подготовки образцов тканей для дальнейшего анализа (гистологическое окрашивание, иммуногистохимии и т.д.). Следующие ссылки приводить примеры, как анализировать взрослого мозга рыбок данио: 9,11,17-20,24-27. Самый быстрый времени наблюдать эффективную нокдаун (более 50% нокдаун) было 12 часов в наших исследованиях 22. 6. Предлагаемая научная управления Использование молекула несоответствие морфолино, что не должно вызывать никаких фенотип в качестве отрицательного контроля. Использование либо стандартный молекула морфолино или морфолино специально конструкция управления для каждого гена. Кроме того, использование растворителя (в данном случае PBS) в качестве дополнительного отрицательного контроля для оценки неспецифических эффектов или токсичности MISMATCH / контролировать морфолиногруппу инъекций. Используйте PCNA Morpholinos описано ранее 22 в качестве положительного контроля. Это вызывает эффективное морфолиногруппу нокдаун во взрослом мозге рыбок данио (75-95% эффективности нокдаун в течение 1 дня инъекций) 22.

Representative Results

Церебровентрикулярных микроинъекции приводит к широкому распространению введенного раствора Использование рабочего процесса и технической схеме церебровентрикулярных микроинъекции показано на рисунке 1, мы назначали морфолиногруппу олигонуклеотидов в мозгу взрослого рыбок данио. Точный протокол инъекции приводит к дисперсии закачиваемой жидкости по всему мозгу и эффективное нацеливание клеток близко к поверхности желудочка (рис. 2А). Инъекции где стеклянного капилляра пронзает ткани мозга будет иметь плотную флуоресцентного сигнала в точке инъекции (фиг. 2В). Если вводится суммы недостаточно, слабая флуоресцентный сигнал будет наблюдаться (рис. 2С). Церебровентрикулярных микроинъекции может быть использован для сбивания экспрессии генов на желудочков области взрослого мозга рыбок данио Мы показали, гона морфолины естественных условиях может проникать несколько диаметров клетки внутри желудочковой поверхности и, следовательно, могут эффективно целевых клетках желудочка (фиг. 3А, 3В). Морфолино инъекции может выражение нокдаун гена, как это будет облегчить производство соответствующего белка (пример PCNA, как показано на фиг.3С, 3D). Ранее нами было показано, что сбить генов с помощью этой техники приводит к функциональным последствиям во время нейрогенез (рис. 3E, 3F) или регенерации ответа (рис. 3G, 3Н). Мы показали, что эффективный диапазон нокдаун (более 50% нокдаун) достигается примерно 12 ч после инъекции морфолины 22. Мы также отметили, что эффективное период нокдаун есть до примерно 5 суток после введения белка PCNA 22. Более 70% нокдауна не было замечено в течение 3 дней после инъекции 22. Нокдауна кривые зависят Oн уровнем экспрессии эндогенного белка и эффективность молекул морфолино, а должен быть определен для каждого гена экспериментатором. В наших исследованиях мы не видели, что процедура CVMI ставит под угрозу выживание животных, вероятно, потому, что администрация молекул морфолиногруппу локальна и не вызывает системную токсичность. Рисунок 1. Схематическое представление церебровентрикулярных техники инъекции. (A) инъекция выполняется из спинной части взрослых данио (1) на уровне тектум (ОТ, 2). Разрез делается по оптической тектума пластины черепа с 30-иглы (3). Использование стеклянных капилляров, морфолино молекулы вводят в жидкость желудочков (4). Тщательный дисперсияchieved мгновенно (5). (B) канюли и ее колючей конец показан на большом увеличении. (C) ориентации иглы до разреза. (D) надреза обведен и изложенные пунктирными линиями. (Е) инъекций капилляр расположен, как показано, и выполняется инъекция. Все панели были адаптированы из работы. 22. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2. Сравнение эффективности инъекций и точности. (А) хорошо инъекции приводит к ориентации клеток близко к желудочковой поверхности. (B) Если стеклянного капилляра вставляется в ткани головного мозга, то будет сформирован в центре сигнала флуоресценции. (C </sЧонг>) Если количество инъекций является низким, это приведет к ослаблению сигнала флуоресценции. Рисунок 3. . Морфолино проникновения, эффективность генной нокдаунов и функциональные последствия () GFP иммуноокрашивания на конечного мозга сечений морфолиногруппу управления впрыском Tg (H2A: GFP) трансгенная линия показывает GFP-положительных ядер. (B) GFP иммуноокрашивания на конечного мозга сечений GFP антисмысловым морфолинодоксорубицин вводят Tg (H2A: GFP) трансгенная линия показывает GFP-положительных ядер. Обратите внимание на разницу в GFP-сигнал на желудочков регионе. V: желудочка. (C) PCNA иммуноокрашивания по контролю морфолиногруппу впрыском мозг показывает широкое распространение PCNA-позитивные клетки. ( <strong> D) PCNA иммуноокрашивания на PCNA антисмысловым морфолиногруппу впрыском мозг показывает значительно сократилось количество PCNA-позитивные клетки, показывая, что может Нокдаун CVMI эндогенных генов. (E) и BrdU Хуком / D иммуноокрашивания по контролю морфолинодоксорубицин вводят мозги, чтобы определить новорожденных нейронов после BrdU пульс-чейз эксперимента, описанного до 22. (F) и BrdU Хуком / D иммуноокрашивания на PCNA антисмысловым морфолинодоксорубицин вводят мозги, чтобы определить новорожденных нейронов после BrdU пульс-чейз эксперимента, описанного до 22. (G) Стук вниз PCNA приводит к значительному уменьшению генерирования новорожденных нейронов, указывая, что CVMI может быть использован для нокдауна эндогенных генов, которые приводят к функциональным последствиям. Все панели были адаптированы из работы. 22 Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Метод, который мы описываем здесь позволяет легко и быстро администрации Morpholinos в взрослом мозге рыбок данио. Мы показали, что наш метод инъекции эффективно блокирует экспрессию гена в клетках желудочка и приводит функциональных последствий в нейрогенез ответа.

Есть важные моменты, чтобы быть осторожными при выполнении церебровентрикулярных микроинъекции. Например, действие молекул морфолино зависит от используемой концентрации. Эта концентрация должна быть определена для конечного пользователя. Мы рекомендуем начать с исходного раствора (500 мкм) и выполнение серийные разведения, а в идеале предварительного теста путем инъекции в эмбрионы с использованием стандартных протоколов эмбриона 28-30 инъекций. Ранее были получены различные уровни эффективности нокдаун с концентрацией морфолины в диапазоне от 50 мкМ до 500 мкМ 22. Во-вторых, отверстие стеклянного капилляра не следует крупэлектронной, так как это приведет к обширным жидкость приток в головном мозге после инъекции. Аналогичным образом, отверстие не должно быть слишком узкими, как это будет препятствовать адекватной инъекции. Можно определить оптимальное отверстие давления комбинации путем откачки воздуха в чашку Петри с водой. Пузырьков, возникающих должно быть в одной строке, но не в несколько строк. Покажем это на видео. В-третьих, инкубирование рыбы в анестетиков имеет решающее значение. Рыбы не должны храниться дольше, чем до 2 мин в анестетиков. Это будет препятствовать скорость восстановления после инъекции. В-четвертых, расположение разрез является критическим для тщательного диспергирования закачиваемой жидкости. Желудочка регионе за тектум больше выше средней линии и сужается с боков. Таким образом, экспериментатор должен генерировать щели в черепе близко к средней линии и только хвостовой к черепу пластину, закрывающую область конечного мозга.

Одним из преимуществ церебровентрикулярных injectioN (CVMI) метода является его оперативность. CVMI быстрый способ анализа функции гена. Это особенно важно и полезно, когда по сравнению с поколение трансгенных линий для функциональных исследований, которое обычно занимает несколько месяцев. Кроме того, CVMI приводит к равномерному распределению закачиваемой жидкости и, следовательно, обеспечивает относительно тщательного манипулирования активность гена, по сравнению с координационным инъекций или электропорации. С CVMI, множественных генов может быть сбит с ног одновременно готовит инъекцию смеси, содержащие несколько олигонуклеотидных Morpholinos. CVMI могут быть использованы для введения различных концентраций данного олигонуклеотида морфолино, и поэтому могут быть использованы для анализа гипоморфных фенотипов. Наконец, этот впрыск парадигма не вызывает токсичность или поставить под угрозу выживание животных.

Методика CVMI могут быть расширены для другого типа исследований, таких как инъекции модулирующее пептиды, лекарства, плазмидной ДНК или РНК модулирующее мескул или других веществ, которые могут влиять на физиологию клеток. Опробование комбинации молекул и проведении анализов доза-эффект возможно при использовании нашего метода, позволяющего гипоморфными изучения фенотипов. С этими свойствами, CVMI оказывается быстрым и легким для анализа исследований экспрессии во взрослом мозге рыбок данио, и открывает быстрый скрининг и функциональный анализ.

Взрослого мозга рыбок данио может конструктивно производить новые нейроны на протяжении всей рострокаудальных оси, а также может регенерировать после травматических повреждений. Это резко контрастирует с мозгом млекопитающих с ограниченными нейрогенеза и если на всех, а бедные регенеративной способностью. Такая широко распространенная активность стволовых клеток и восстановления сил способность делает данио полезны организму моделью для понимания молекулярных программ, необходимых для регенерации центральной нервной системы, которые в настоящее время в значительной степени неизвестными. Таким образом, исследования молекулярной основы регенеративной способности Зеbrafish мозг интересную область исследований, которые могли бы объяснить принципиальную разницу как рыбы и млекопитающих мозг реагирует после травмы, а также наделить возможности для регенеративной терапии в медицинском людей. Для того, чтобы понять молекулярные инфраструктуры позвоночных пластичности мозга и регенерации, глиальные клетки служат важной областью исследований, поскольку они являются прародителями нейрогенное 3,8,20. Таким образом, используя CVMI приема изменения функции генов в радиальных глиальных клетках мозга рыбок данио играет важную роль в выяснении как рыбы мозг может пару предшественников к эффективной деятельности нейрогенеза взрослого и регенеративный ответ. Недавно нами было показано участие и требования нескольких факторов и сигнальных путей в регенеративный ответ нейрогенез мозг взрослого данио 24,26,27, и эти исследования стали возможными благодаря использованию метода CVMI. В целом, знания мы получаем от мозга рыбок данио можно было бы использовать навязать Regenerative способность млекопитающих глиальные клетки, которые реагируют на травмы и, следовательно, будет способствовать разработке клинической терапии для человека неврологические расстройства и острые травмы.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Немецкого Forschungsgemeinschaft (SFB 655) и Европейского Союза (ZF-здоровья).

Materials

Reagent/Material
CellTracker Red CMTPX Life Technologies, Invitrogen C34552 Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing the fish
Petri dishes Sarstedt 821,472 For handling the fish during injection and imaging
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056 As sterile dilution medium
Vivo morpholinos Gene Tools Inc. Customized More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com
Equipment
Barbed-end needle Becton-Dickinson 305178 To generate the incision in the skull
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer Part of the whole injection setup
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985 To snap off the tip of the glass capillary
Fluorescence camera Zeiss, Nikon, Leica Varies with the manufacturer To visualize the fluorescence after injection
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265 To hold the fish in position
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10 For microinjection
PicoNozzle kit (microinjector holder) World Precision Instruments 5430-12 For microinjection
Pneumatic PicoPump (microinjector) World Precision Instruments SYS-PV820 For microinjection
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG For illuminating the specimen
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stocum, D. . Regenerative Biology and Medicine. , (2006).
  2. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  3. Doetsch, F., Scharff, C. Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals. Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).
  4. Kaslin, J., et al. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  5. Kizil, C., et al. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  6. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev. Genes Evol. , (2013).
  7. Kempermann, G. . Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).
  8. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).
  9. Grandel, H., et al. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell. 295 (1), 263-277 (2006).
  10. Chapouton, P., et al. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  11. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  12. Byrd, C. A., Brunjes, P. C. Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish. Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).
  13. Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
  14. Lam, C. S., et al. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish. 238 (2), 475-486 (2009).
  15. Wang, X., et al. Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus. Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).
  16. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).
  17. Ganz, J., et al. Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon. Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).
  18. März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
  19. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  20. Kroehne, V., et al. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  21. Ito, Y., et al. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).
  22. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  23. Morcos, P. A., et al. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).
  24. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  25. Chapouton, P., et al. her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain. Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).
  26. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  27. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  28. Rosen, J. N., et al. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  30. Rikin, A., et al. A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).

Tags

Gene ExpressionAdult Zebrafish BrainCerebroventricular MicroinjectionMorpholino OligonucleotidesRadial Glial CellsNeurogenesisNeurodegenerationCentral Nervous System Regeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (75), e50415, doi:10.3791/50415 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image