في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.
مطلوب التلاعب في التعبير الجيني في الأنسجة لإجراء دراسات وظيفية. في هذه الورقة، ونحن لشرح حقن مكروي cerebroventricular (CVMI) تقنية كوسيلة لتعديل التعبير الجيني في الزرد الدماغ الكبار. باستخدام CVMI، يمكن أن تدار المواد في السائل cerebroventricular ويتم توزيعها بدقة على طول محور rostrocaudal من الدماغ. ونحن نركز بشكل خاص على استخدام العقاقير morpholino أليغنوكليوتيد]، التي هي أدوات قوية لاسقاط التعبير الجيني في الجسم الحي. في أسلوبنا، عند تطبيقها، وتتخذ الجزيئات morpholino من قبل الخلايا المبطنة للسطح البطين. وتشمل هذه الخلايا الخلايا الدبقية شعاعي، التي تعمل بمثابة الأسلاف العصبية. ولذلك، هدمت التعبير الجيني في الخلايا الدبقية شعاعي أمر في غاية الأهمية لتحليل استجابة الخلايا العصبية على نطاق واسع في الزرد، وأيضا من شأنه أن يوفر نظرة ثاقبة كيف يمكن الحفاظ على الفقاريات نوروجين الكباراستجابة ESIS. ان مثل هذا الفهم يساعد أيضا الجهود المبذولة من أجل التطبيقات السريرية في اضطرابات الاعصاب الإنسان ووسط تجديد الجهاز العصبي. وبالتالي، فإننا نقدم طريقة حقن مكروي cerebroventricular كوسيلة سريعة وفعالة لتغيير التعبير الجيني واستجابة الخلايا العصبية في الدماغ المقدم الزرد الكبار. كما نقدم نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها وغيرها من المعلومات المفيدة حول كيفية تنفيذ الإجراء CVMI.
تكوين الخلايا العصبية الكبار هو سمة مشتركة بين الفقاريات، لكن درجته من انتشار وكفاءة يختلف مع نسالة 1،2،3،4،5،6. على سبيل المثال، أدمغة الثدييات الكبار تحتوي على مناطق الخلايا الجذعية محدود إلى حد كبير إلى الدماغ الأمامي 7،8، في حين أن الزرد مكتملة العظام يحتوي على ستة عشر مختلف المجالات الخلايا الجذعية العصبية المرتبطة بها ومناطق في الدماغ بكامله 4،5،9،10. هذا الاختلاف بين الثدييات والزرد قد تعكس وجود تفاوت في آليات صيانة الخلايا الجذعية والقدرة العصبية من الخلايا الاصلية. يمكن أن اختصاص مدى الحياة من الزرد لإنتاج الخلايا العصبية في الدماغ تشكل أيضا تشعبات السريرية والآليات الجزيئية التي تستخدمها الزرد الدماغ يمكن تسخيرها للتطبيقات العلاجية لمعالجة الاضطرابات العصبية لدى البشر.
وقد تم تحليل العديد من الخلايا الجذعية مناطق من الدماغ الزرد الكبار، ولقد ثبت أنالخلايا المبطنة للسطح البطين من تلك المناطق بمثابة الخلايا الاصلية 9،11-20. تحليلات مفصلة في الدماغ الانتهائي الزرد، على سبيل المثال، حدد الخلايا الدبقية شعاعي، التي تحدد السطح البطيني من هذه المنطقة في الدماغ لتكون الأسلاف العصبية 19 و 20. هذا ينطبق على المناطق الأخرى مثل المخيخ والسقف البصري، حيث ventricularly، وتقع خلايا عصبية ظهارية توفير المدخلات العصبية 16،21. وتحقيقا لهذه الغاية، فهم الآليات الجزيئية التي تنظم الكفاءة العصبية انتشارا في البالغين الزرد الدماغ يتطلب التلاعب في التعبير الجيني في الخلايا الاصلية.
وقد وصفت وسائل مختلفة من قبل لتحوير وظيفة الجين في الزرد. وتشمل هذه الجيل من خطوط المعدلة وراثيا المشروطة التعبير عن المتغيرات المطلوبة من البروتين الحقن تنسيق وحيد، القائم على البلازميد بالإضافة إلى electroporation أو الكيميائية العلاجات. نحن سابقا بتصميمطريقة لإدارة المواد المختلفة بما في ذلك [أليغنوكليوتيد أو morpholino البروتينات في الدماغ الزرد الكبار باستخدام حقن مكروي cerebroventricular كوسيلة سريعة وفعالة من تحوير وظيفة الجين في خلايا البطين من الدماغ المقدم الزرد الكبار 22. في دراساتنا، واستخدمت morpholinos الجسم الحي بسبب الكيمياء التي تنطوي على جزيء morpholino مرتبطة تساهميا إلى أرجينين الببتيدات تسليم الغنية، والتي تتيح تسليم كفاءة لخلايا الفائدة دون الحاجة إلى permeabilization إضافية مثل electroporation 23. وهذا من شأنه السماح لاستهداف شامل للنسيج المطلوب بعد الحقن، تماما مثل ما لاحظنا في الزرد الكبار الدماغ الانتهائي 22. استخدام morpholinos فيفو بالتالي فهي متفوقة على الأساليب القائمة بالفعل من الأنسجة استهداف مثل electroporation أو حقن التنسيق من جزيئات الحمض النووي.
هنا، علينا أن نظهر بصريا كيف يمكننا تنفيذ هذه العملية وتوفيربروتوكول خطوة بخطوة. نبدأ مع شرح إعداد خليط حقن والأسماك ليتم حقنه، والمضي قدما من خلال إظهار كيف يتم تعيين جهاز حقن ما يصل. ونحن نقدم وصفا للطريقة حقن cerebroventricular، الذي ينطوي على توليد شق في الجمجمة وحقن morpholinos باستخدام microinjector. نحن أيضا تفاصيل عن النقاط الحرجة يحتاج المرء أن يكون حذرا في أثناء إجراء كله بالقول بأنها الأمثل أو أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
الأسلوب وصفنا هنا يسمح إدارة سهلة وسريعة من morpholinos في الزرد الدماغ الكبار. لقد أثبتنا أن طريقة الحقن لدينا يمنع التعبير الجيني بكفاءة في الخلايا البطين والنتائج في عواقب وظيفية في الخلايا العصبية استجابة.
هناك نقطة هامة أن يكون حذرا حول أثناء تنفيذ حقن مكروي cerebroventricular. على سبيل المثال، تأثير الجزيئات morpholino يعتمد على التركيز المستخدم. هذا التركيز يجب أن يحدده المستخدم النهائي. نوصي بدءا من محلول المخزون (500 ميكرون) وإجراء التخفيفات المتسلسلة، ومثالي لمرحلة ما قبل الاختبار عن طريق الحقن في الأجنة باستخدام معيار حقن الجنين بروتوكولات 28-30. سابقا، حصلنا على مستويات مختلفة من الكفاءة ضربة قاضية مع تركيزات morpholinos تتراوح من 50 ميكرون إلى 500 ميكرون 22. الثانية، وفتحة من الزجاج الشعرية لا ينبغي أن تأوسوف البريد لأن هذا يؤدي إلى تدفق السائل واسعة في الدماغ بعد الحقن. وبالمثل، يجب فتح لا تكون ضيقة جدا حيث سيؤدي ذلك إلى منع حقن كافية. يمكن للمرء تحديد الأمثل مزيج فوهة الضغط عن طريق ضخ الهواء في طبق بيتري مع الماء. ينبغي أن تكون الفقاعات الناشئة في صف واحد ولكن ليس في صفوف متعددة. علينا أن نظهر هذا في شريط الفيديو. ثالثا، يحتضنها الأسماك في التخدير أمر بالغ الأهمية. لا ينبغي أن تبقى السمكة أطول من 2 دقيقة في التخدير. وهذا يعيق معدل الاسترداد بعد الحقن. الرابعة، وموقع من شق هو أمر حاسم لتفريق بدقة السائل المحقون. منطقة البطين خلال السقف البصري أكبر فوق خط الوسط ويحصل أضيق أفقيا. ولذلك، ينبغي أن المجرب توليد فتحة في الجمجمة لإغلاق خط الوسط والذيلية لمجرد لوحة جمجمة تغطي منطقة الدماغ الانتهائي.
واحدة من المزايا التي تتمتع بها مباشرة صب cerebroventricularن طريقة (CVMI) هو rapidness لها. CVMI هو وسيلة سريعة لمعايرة وظيفة الجين. هذه الميزة مهمة ومفيدة بالمقارنة مع جيل من خطوط المعدلة وراثيا للدراسات الفنية، والتي تأخذ عادة عدة أشهر. بالإضافة إلى ذلك، CVMI يؤدي إلى توزيع موحد للسائل المحقون وبالتالي يوفر التلاعب شامل نسبيا من النشاط الجيني، بالمقارنة مع الحقن تنسيق أو electroporation. مع CVMI، يمكن طرقت جينات متعددة في وقت واحد أسفل من خلال إعداد الحقن التي تحتوي على خليط morpholinos متعددة قليل النوكليوتيد. CVMI يمكن استخدامها لحقن تركيزات مختلفة من إعطاء أليغنوكليوتيد] morpholino، وبالتالي يمكن استخدامها لتحليل الظواهر hypomorphic. وأخيرا، هذا النموذج الحقن لا يسبب سمية أو تعرض للخطر بقاء هذه الحيوانات.
يمكن توسيع نطاق هذه التقنية CVMI لنوع آخر من الدراسات مثل حقن من الببتيدات تغييري، والمخدرات، DNA البلازميد أو تغييري RNA موlecules أو غيرها من المواد التي قد تؤثر على علم وظائف الأعضاء من الخلايا. يعاير مزيج من جزيئات وإجراء تحليلات الاستجابة للجرعة ممكنة باستخدام طريقة لدينا، مما يسمح بدراسة الظواهر hypomorphic. مع هذه الخصائص، CVMI يبرهن على أن تكون مقايسة سريعة وسهلة للدراسات التعبير في الزرد الدماغ الكبار، ويفتح الفحص السريع والتحليلات الفنية.
الزرد الدماغ الكبار يمكن ان تنتج خلايا عصبية جديدة جوهري على طول محور rostrocaudal كله، وأنه يمكن أيضا تجديد بعد الإصابات. هذا هو في تناقض صارخ مع أدمغة الثدييات مع تكوين الخلايا العصبية محدودة وعلى كل حال، بدلا من الفقراء قدرة التجدد. هذا على نطاق واسع نشاط الخلايا الجذعية وقدرتها الاستجمام يجعل الزرد كائن نموذج مفيد لفهم البرامج الجزيئية اللازمة لتجديد الجهاز العصبي المركزي، والتي هي غير معروفة إلى حد كبير حاليا. ولذلك، والتحقيق في الأساس الجزيئي للالموهبه التجدد زيbrafish الدماغ هو عالم مثير للاهتمام من البحوث التي قد تفسر الفرق الأساسي كيفية رد فعل الأسماك والثدييات العقول بعد الإصابة، وأيضا منح سبل العلاجات الطبية التجدد في البشر. من أجل فهم البنية التحتية الجزيئية من الفقاريات اللدونة الدماغ وتجديد، والخلايا الدبقية بمثابة منطقة بحثية هامة لأنها هي الأسلاف العصبية 3،8،20. وهكذا، وذلك باستخدام تقنية CVMI لتغيير وظيفة الجين في الخلايا الدبقية شعاعي من الدماغ الزرد هو دور فعال في توضيح كيف يمكن لنشاط السلف الزوجين لكفاءة الخلايا العصبية الكبار واستجابة التجدد الدماغ الأسماك. لقد أظهرنا مؤخرا تورط وشرط من عدة عوامل ومسارات الإشارات في استجابة الخلايا العصبية على التجدد من الدماغ الزرد الكبار 24،26،27، وقدمت هذه الدراسات ممكن عن طريق استخدام أسلوب CVMI. وعموما، فإن المعرفة التي نكتسبها من الزرد الدماغ يمكن تسخيرها لفرض regeneالقدرة rative إلى الخلايا الدبقية الثدييات التي تتفاعل إلى وقوع إصابات وبالتالي سوف تساعد على تصميم علاجات سريرية لعلاج الاضطرابات العصبية البشرية والإصابات الحادة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (SFB 655) والاتحاد الأوروبي (ZF-الصحية).
Reagent/Material | |||
CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
Equipment | |||
Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |