Свободные радикалы в химической биологии: от химического поведения в биомаркеров развития

1. Синтез моно-транс-изомеров эфиров холестерина Растворите эфиров холестерина (линолеат или арахидоната эфира холестерина) в 2-пропанол (15 мм). Для лучшего растворения, образцы обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин в атмосфере аргона. Передача решения кварца фотохимического реактора, добавьте 2-меркаптоэтанол в 2-пропанол (для достижения 7 мМ концентрации от 2 M раствор тиоловых). Флеш реакционной смеси с аргоном в течение 20 минут для того, чтобы устранить присутствие кислорода в растворе. Облучения реакционной смеси с помощью УФ-света с помощью 5.5W низкого давления ртутных ламп на 22 ± 2 ° С в течение 4 мин. Монитор аналитической Ag-TLC (серебристо-тонкослойной хроматографии) для доказательства формирования моно-транс эфиров холестерина (см. рисунок 1 для химических формул). Окрашивание TLC осуществляется путем заливки плиты в церия аммония молибдата (CAM) решения, а пятна появляются на отоплениепластину. Quench реакция на ранней стадии, с тем чтобы восстановить исходный материал, который может быть повторно использован для выполнения других раундах изомеризации, получение увеличение общей урожайности. Сбор в реакционную смесь в круглодонную колбу, стиральные устройства с несколькими мл 2-пропанола. Удалите растворитель и очистить моно-транс-изомеров эфиров холестерина на Ag-TLC, как описано в литературе. 5 Использование гексан-диэтиловый эфир (9:1 об / об) в качестве элюента для моно-транс-изомеров линолеат холестерина, в то время как использование гексана -диэтиловый эфир уксусной кислоты (9:1:0,1 об / об) для моно-транс-изомеров арахидоната холестерина. 2. Выделение доли эфиров холестерина из сыворотки крови человека Развести 1 мл сыворотки крови человека (полученный путем центрифугирования крови) с 1 мл рассола и залить раствор в делительную воронку под струю аргона для того, чтобы избежать артефактов (например, аддукты окисления). Добавить 10 мл хлороформ-метанол (2: 1 о / о) трижды. Встряхните делительную воронку очень медленно для того, чтобы ограничить образование эмульсии в связи с наличием альбумина. Вымойте органические слои один раз солевым раствором (10 мл), затем собирают в колбу в токе аргона, сушат над безводным сульфатом натрия. Удалить летучих роторном испарителе с получением желтого масла (общей липидной фракции плазмы). Возьмите сырую с 1 мл хлороформ-метанол (2:1 об / об), нагрузка на препаративной ТСХ в потоке аргона и использовать смесь гексан-диэтиловый эфир (9:1 об / об) в качестве элюента . Соскоблите кремнезема часть, содержащую холестерина фракции эфира и налить в сосуд. Тогда, извлекать диоксид кремния (3 × 5 мл) смесью хлороформ-метанол (2:1 об / об), собирать органические слои и удаления растворителя после испарения с получением чистого доля эфиров холестерина (обычно ~ 1,5 мг). Держите эфиров холестерина в темном флаконе покрыта алюминиевой фольгой в атмосфере аргона и хранить при температуре -20 ° C. Холестерил электроннойбеспризорных чувствительны к свету и кислороду. 3. Характеристика Mono-транс эфиров холестерина по спектроскопии комбинационного рассеяния Извлечение эфиров холестерина из сыворотки крови человека (≥ 0,7 мг), как описано в разделе 2, растворяют в небольшом количестве четыреххлористого углерода (≤ 10 мкл) и поместить в пузырек. CCl 4 выбран в качестве растворителя, потому что его сигнал КР не пересекается с областью интересов холестерина анализ эфира. Перенесите решение держатель образца через одноразовые пипетки стекла, затем осторожно удалите растворитель медленном потоке аргона. После равномерного маслянистая пленка образуется на внутренней стенке держателя образца, установите его в прибор для измерения. Преобразованию Фурье спектр КРС эфиров холестерина напрямую получить на липидный экстракт без каких-либо производных реакции. Мощность лазера на образец <100 мВт, чтобы избежать повреждения образца. Общее количество сканированийДля каждого спектра ≥ 800, чтобы минимизировать фоновый шум. 1,700-1,630 см -1 диапазоне спектра комбинационного рассеяния анализируются, поскольку она отражает вклад от С = С двойной связи в молекуле (C = C режим растяжения). Кривой анализ проводится в этом регионе, что позволяет отличительной наложенных взносов цис-и транс двойных связей в жирных алкильной цепи и двойной связи в кольце B холестерина (см. Рисунок 2). Чтобы соответствовать правильно колебательных полос, некоторые параметры должны быть фиксированными или ограничены в разумных пределах. Профили компонента пика описывается как линейная комбинация лоренцевой и гауссовой функции, в то время как половина высоты полосы лучше всего определяется процедура оптимизации компьютера. Количество и расположение компонентов пики, полученные с использованием четвертой производной спектра, которая позволяет обнаружить и некоторые слабые полосы компонента. Поскольку сигналшум которая ухудшается при дифференцировании сигнала может препятствовать использованию четвертой производной, разгладил четвертой производных с тринадцатилетней точки Савицкого-Голея функции, имеют преимущество, таким образом, правильный компромисс между разрешающей способностью и отношение сигнал-шум получается . Лучший кривой получены при минимально возможных значений с 2. Наличие транс-изомеров раскрывается компонента на 1671 ± 1 см -1, в дополнение к, по крайней мере, два компонента, немного сместился в сторону более низких частот, в связи с цепи жирной кислоты и холестерин, С = С двойной связи. Представитель спектра комбинационного рассеяния плазменных эфира холестерина показано на рисунке 9. На вставке сравнении с конкретным регионом холестерина линолеат и моно-транс холестерина линолевой кислоты изомеров показано на рисунке. 4. Дериватизация в Метиловые эфиры жирных кислот (FAME) и анализ с помощью газовой хроматографии Растворятьсяэфиров холестерина (~ 1,5 мг) с 0,5 мл 1 М раствора гидроксида натрия в бензол-метанол (2:3 об / об) и место в темном флаконе покрыта алюминиевой фольгой в атмосфере аргона. Оставьте смесь перемешивают при комнатной температуре и монитора с помощью тонкослойной хроматографии с использованием смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1 об / об) в качестве элюента. Время реакции обычно составляет 30 минут, но тщательный мониторинг реакции не требуется. В самом деле, когда соответствующие метиловые эфиры образуются, реакция должна быть гасится для того, чтобы избежать образования деградации и побочных продуктов. ТСХ количественного формирования метиловых эфиров. Quench реакционной смеси добавляют 1 мл солевого раствора и извлечения метиловых эфиров н-гексаном (3 × 2 мл). Сбор органических слоев в пробирку и растворитель удаляют на роторном испарителе с получением фракции метиловый эфир, который затем используется для анализа GC без дополнительной очистки. Растворите метиловых эфиров в минимальном количестве н-гексана (обычно 1 мг в 50 мкл) и ввести в ГК оснащена 60 м × 0,25 мм × 0,25 мкм (50%-цианопропил)-methylpolysiloxane колонки. Используйте детектор ионизации пламени (FID) со следующей программой печи: температура начала при 165 ° C, удерживайте в течение 3 мин, а затем увеличение на 1 ° С / мин до 195 ° C, удерживайте в течение 40 мин, затем второй на 10 ° C / мин до 240 ° C, и удерживайте в течение 10 мин. Режим постоянного давления (29 фунтов на квадратный дюйм) выбран. Гелий или водород может использоваться в качестве газа-носителя. Метиловых эфиров идентифицируются по сравнению с временами удерживания подлинных образцов. Рисунке 10 показано представитель GC анализа FAME полученных из плазмы эфиров холестерина. 5. Синтез (5'R) – и (5'S) -5 ',8-цикло-2 "-дезоксиаденозин Растворите 33 мг 8-бром-2'-дезоксиаденозина (8-Br-Дадо) в ацетонитриле (100 мл) для того, чтобы достигать 1 мм концентрации. Регулирование потока газа (Ar или N2) в фотореактора и заполнить APPARatus с решением 8-Br-Дадо. Подготовка перегородки с соответствующим размером для ввода фотореактора и передать иглу подключен к линии инертного газа через центр его. Закройте системы с перегородкой. Промойте инертного газа в течение 30 мин. Облучения УФ-светом использованием 125W среднего давления ртутных ламп на 22 ± 2 ° С в течение 15 мин, собирают раствор в 250 мл колбу. Вымойте фотореактора с 10 мл ацетонитрила и собирать промывные в той же колбе. Quench сырой реакционной смеси 1 М NH 4 OH решения и испарения растворителя в ротационном испарителе. Выполнить высокоэффективной жидкостной хроматографический анализ (ВЭЖХ-УФ) с аналитической колонке (см. приборный отсек) при известных условиях, и сравнить профиль со ссылкой соединений. Выполнить высокоэффективной жидкостной хроматографический анализ (ВЭЖХ-УФ) с аналитической колонке (см. приборный отсек) с помощью следующей зольвентиляционные отверстия и градиентов: 2 мМ формиата аммония в качестве растворителя и ацетонитрила в качестве растворителя B. Установить расход на 1 мл / мин, а градиент от 0% растворителя B до 0,3% растворителя B должны быть достигнуты в 2,2 мин. Тогда 0,8% растворителя B в в 4,0 мин, затем 1% растворителя B в 4,8 мин. Оставайтесь на 1% растворителя B в течение 9 минут, а затем перейти к 8% растворителя B в 6 мин. После перехода на 10% растворителя B в 4 минуты и 30% растворителя B в течение 5 мин и остается на уровне 30% растворителя В других 5 мин. Сбор хроматографических пиков, соответствующих двум диастереомерных продуктов в двух разных флаконах. Измерить абсорбцию из двух собранных фракций в УФ-спектрофотометр и рассчитать точную концентрацию на основе Ламбер-Бера (A = εlC, где это поглощение, ε коэффициент вымирания и л длина ячейки). Используйте ε коэффициент экстинкции 2'-дезоксиаденозина (Дадо) (15400 М -1 см -1 при 260 нм). 6. Синтез (5'R) -D (5'S) -5 ',8-цикло-2 "-дезоксигуанозина Растворите 35 мг 8-бром-2'-дезоксигуанозина (8-Br-dGuo) и 30 мг йодида натрия (NaI) в дистиллированной воде (100 мл), чтобы достичь 1 мм и 2 мМ концентрации, соответственно. Регулирование инертного газа (Ar или N 2) поток связан с фотореактора и заполнить фотореактора с реакцией решение. Degass реакционной смеси, как описано в процедуре 5 (стадия б). Облучения УФ-светом использованием 125W среднего давления ртутных ламп на 22 ± 2 ° С в течение 30 мин, собирают раствор в 250 мл колбу. Вымойте фотореактора с 10 мл воды и сбора промывных в той же колбе. Quench сырой реакционной смеси 1 М NH 4 OH решения и испарения растворителя в вакууме. Выполнить анализ, как описано в процедуре 5 (шаги е в г). Используйте ε коэффициент экстинкции 2'-дезоксигуанозина (dGuo) (11700 М -1 см -1 при 260 нм). 7. Синтез Изотопный Маркированный пуринов (5'R) – и (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides Подготовьте 2 мл 1 мМ водного раствора (дистиллированная вода) 15 N изотопного помечены пуриновых нуклеозидов ([15N 5] Dado или [15N 5] dGuo) в стеклянный флакон (4 мл) с крышкой перегородки. Подключите флакон с крышкой перегородки и подключиться к газопроводу (N 2 O для насыщения раствора) через иглу в перегородке, которая достигает дна флакона. Еще одна короткая игла в перегородке крышки работает выхода газа. Промойте решение с N 2 O в течение 30 мин. Поток газа регулируется, чтобы быть очень низкой. Выход иглы сначала вынимают и после 1 'длинный следует, чтобы иметь небольшое давление внутри флакона. Положите раствор в аппарате гамма-радиолиза в течение 8 часов (расчет на основе дозы ок. 4,5 Гр / мин). После реакции утолить нефть с 1 M NH 4 </sUB> OH решение. Выполнить высокоэффективной жидкостной хроматографический анализ (ВЭЖХ-УФ) при известных условиях, 6 и сравнить хроматограмме со стандартными ссылками. 8. Гамма радиолиза водных растворов ДНК Подготовить 1 мл 0,5 мг / мл раствора (дистиллированная вода) ДНК зобной железы теленка и положить в стеклянный флакон (2 мл) с крышкой перегородки. Degass реакции, как описано в процедуре 7 (шаги BD). Положите раствор в аппарате гамма-радиолиза в течение 30 минут (расчет на основе дозу / скорость ок. 4,5 Гр / мин). 9. Ферментативного расщепления ДНК Для трубки Эппендорф, содержащие 80 мкг ДНК, добавить 8 U нуклеазы P1, 0,01 U фосфодиэстеразы II, 20 нмоль EHNA в 20 мкл 300 мМ ацетата натрия (рН 5,6) и 10 мМ хлорида цинка. Выдержите эту смесь при температуре 37 ° С в течение 48 часов. Затем добавьте смесь из 8 U щелочной фосфатазы, 0,02 U из phosphodiesterasE I, в 40 мкл 0,5 М Трис-HCl буфером (рН 8,9) в смеси пищеварения. Образец инкубируют при 37 ° С в течение 2 часов. Смесь нейтрализуют добавлением 10% муравьиной кислоты. Передача образца Amicon Ultra-0,5 центробежный фильтр устройства (отсечка 3 кДа), добавить 200 мкл тридистиллированную H 2 O. Поместите Ultra-фильтр в ротора центрифуги при 14000 х г в течение 15 мин. Затем отделить Ультра фильтрующее устройство от микроцентрифужных трубку. Lyophilize фермент-бесплатное решение в микроцентрифуге трубку. 10. Образец ДНК Опреснение до анализа Выполнить высокоэффективной жидкостной хроматографический анализ (ВЭЖХ-УФ) с аналитической колонке (см. приборный отсек) после известных условиях 6. Растворить лиофилизированный расщепленной ДНК в 20 мкл H 2 O и вводят в ВЭЖХ-УФ. Соберите образец в пробирку после солью элюирования (первых минут) и непосредственно перед элюирования тиме первый нуклеозидов (5'R-cdGuo), до конца хроматографического программы. Образец лиофилизировали и resolubilized в 20 мкл воды. 11. LC-MS/MS Количественный анализ Подготовка HPLC-MS/MS (тройной квадрупольный) перед началом анализа загрузки аналитического метода и метода детектор MS (ESI) 6. Добавить 1 мкл изотопного меченых соединений смеси в образец, полученный в процедуре 7. Inject 20 мкл шипами расщепленной ДНК раствор в дистиллированной воде. Полученные данные хроматографического разработаны на основе предыдущей калибровки со ссылкой соединений. Представитель ВЭЖХ запустить содержащие аденозина и гуанозина 2'-дезоксирибонуклеозиды и их окислительное и цикло производными показано на рисунке 11.