Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

1. Kolesteril esterler, mono-trans izomerleri sentezi 2-propanol içinde kolesteril esterler (linoleat veya Arakidonat kolesteril ester) (15 mM) eritilir. Daha iyi bir solubilizasyon için, numuneler argon altında 15 dakika sonike edildi. (7 mM konsantrasyonuna ulaşmak için, tiyol ve bir 2 M stok çözeltiden) 2-propanol içinde 2-merkaptoetanol ekleme, bir kuvars reaktör fotokimyasal için çözelti aktarın. Çözelti içinde oksijen varlığı ortadan kaldırmak için 20 dakika süre ile argon ile reaksiyon karışımının yıkayın. 22, bir 5.5W düşük basınçlı cıva lamba kullanarak, UV ışığı ile reaksiyon karışımının saçmak ± 2 ° C'de 4 dak. Monitör tarafından analitik Ag-TLC (gümüş ince tabaka kromatografisi) deliller mono-trans kolesteril esterlerin oluşumu (kimyasal formüller için bakınız Şekil 1) için. TLC boyama seryum amonyum molibdat (CAM) çözüm plaka dökerek yürütülen ve noktalar ısıtma görünür olduğuplakası. Genel ürün verimi ile bir artış elde izomerizasyon bölgesinin diğer mermi gerçekleştirmek için yeniden kullanılabilir, başlangıç ​​materyali, tekrar elde edilmesi için, bir ilk aşamada, reaksiyon dindir. 2-propanol birkaç ml ile yıkama aletin, bir yuvarlak tabanlı şişe içerisinde reaksiyon karışımı toplayın. Çözücü çıkarın ve literatürde tarif Ag-TLC ile kolesteril esterlerin mono-trans izomerleri hem de temizler. 5 kullanımlar mono-trans izomerleri için kolesteril linoleat eluent olarak heksan-dietil eter (9:1 v / v), ancak kullanım hekzan mono-trans kolesteril Arakidonat izomerleri-dietil eter-asetik asit (9:1:0,1 v / v). 2. İnsan Serum gelen Kolesteril Esterler Kesir İzolasyonu 1 ml tuzlu su ile insan serumu (kan santrifüjleme ile elde edilir) 1 ml seyreltin ve kalıntıya (örneğin, oksidasyon adducts) önlemek için, bir argon akışı altında bir ayırma hunisi içine çözelti dökülür. Ekleyin 10 ml kloroform-metanol (2: Üç kere 1 v / v). Albümin varlığı nedeniyle emülsiyon oluşumu sınırlandırmak için çok yavaş bir şekilde ayırma hunisi çalkalayın. Tuzlu su (10 ml) ile bir defa yıkanır, organik katmanlar, daha sonra susuz sodyum sülfat üzerinde kuru bir argon akışı altında bir Erlenmeyer şişesi içinde toplamak. Sarı bir yağ (toplam plazma lipit fraksiyonu) vermek üzere döner buharlaştırma ile uçucu maddeler çıkarın. Kloroform-metanol ve 1 ml (2:1 v / v), argon akımı altında, bir preparatif TLC üzerine yük ile ham yukarı çıkar ve süzücü olarak heksan-dietil eter (9:1 v / v) oluşan bir karışım kullanmak . Kolesteril ester fraksiyonu içeren silika kısmı kazıyın ve bir şişeye dökün. Sonra, kloroform-metanol (2:1 v / v) ile (3 x 5 ml) ile silis özü, organik tabakalar toplamak ve kolesteril esterler (genellikle yaklaşık 1.5 mg) saf fraksiyon vermek üzere buharlaştırma sonra çözücü çıkarın. -20 ° C'de argon ve deposunun altında alüminyum folyo kaplı, karanlık bir flakonda kolesteril esterleri tutun Kolesteril esters ışık ve oksijen duyarlıdır. 3. Raman Spektroskopisi ile Mono-trans Kolesteril Esterler Karakterizasyonu Bölüm 2'de tarif edildiği gibi insan serumu (≥ 0.7 mg), kolesteril ester Özü, karbon tetraklorid (≤ 10 ul) ve bir şişe içinde bir yerde az bir miktar içinde çözülür. Raman sinyalini kolesteril ester analizlerine ilgi bölge ile örtüşmeyen çünkü CCl 4 çözücü olarak seçilir. Bir tek cam pipet ile numune tutucu çözüm aktarın, sonra dikkatlice argon yavaş akımı ile çözücü çıkarın. Homojen bir yağlı film numune tutucusunun iç duvarı üzerinde oluşturulan sonra, ölçüm için araç içine ikinci yerleştirin. Fourier kolesteril esterlerin Raman spektrumu doğrudan herhangi türevlendirme reaksiyon olmadan lipit özü elde edilir Dönüştürülmüş. Örnek üzerinde lazer güç örnek hasarı önlemek için <100 mW. Taramaların toplam sayısıher spektrum için arka plan gürültüsünü en aza indirmek için ≥ 800 olduğunu. Bu molekül (C = C modunda germe) içinde mevcut bulunan C = C çift bağının ikinci katkı yansıtır beri Raman spektrumunun 1,700-1,630 cm-1 dizi analiz edilmiştir. Bir eğri uydurma analizi böylece sağlayan, bu bölge üzerinde gerçekleştirilen yağlı alkil zinciri ve kolesterol halkası B çift bağı (bkz. Şekil 2) olarak cis ve trans çift bağ gelen bindirilmiş katkıları ayırt. Doğru titreşim bandlarının sığdırmak için, bazı parametreler sabit veya makul sınırlar içinde kısıtlı olmalıdır. Yarı yükseklikte band genişlikleri en bilgisayar optimizasyon rutin ile tespit edilir ise bileşen doruk profilleri, Lorentz ve Gauss fonksiyonlarının doğrusal bir bileşimi olarak tarif edilmektedir. Bileşen tepe noktalarının sayısı ve konumu, aynı zamanda, bazı bileşen zayıf bantlar saptamaya olanak sağlar dördüncü türev spektrumları kullanılarak elde edilmiştir. Yana sinyaliBöylece, gürültü oranı çözünürlük ve sinyal arasında doğru uzlaşma elde edilir; sinyal farklılaşma üzerine bozulur dördüncü türev kullanılmasına engel olabilir, bir on dört noktada Savitsky-Golay fonksiyonu ile dördüncü türevleri düzeltti, avantajı vardır gürültü oranı . En iyi eğri uydurma mümkün olan en düşük c 2 değerleri elde edilir. Trans izomerleri varlığı 1671 az bileşen ± 1 yağlı asit zinciri nedeniyle biraz daha düşük frekanslara doğru kaydırılır ek olarak cm-1, en ​​azından iki bileşenden, kolesterol ve C = C çift bağı ile ortaya çıkar. Plazma kolesteril ester Örnek Raman spektrumu Şekil 9'da gösterilmiştir. Ilave kolesteril linoleat mono-ve trans izomerleri kolesteril linoleik asit ile belirli bir bölgede karşılaştırılması gösterilmektedir. 4. Yağ asidi metil esterleri (FAME) ve Gaz Kromatografisi ile Analizi Türevlendirme Eritmekargon altında alüminyum folyo ile kaplanmış bir şişe içinde koyu bir 1 M benzen-metanol içinde sodyum hidroksit çözeltisi (2:3 v / v) ile yer ve 0,5 ml kolesteril esterler (yaklaşık 1.5 mg). Karışım eluent olarak heksan-dietil eter (9:1 v / v) karışımı kullanılarak TLC ile oda sıcaklığında ve monitör karıştırıldıktan bırakın. Tepki süresi genellikle 30 dakikadır, ancak dikkatli bir reaksiyon izlem gereklidir. Karşılık gelen metil ester oluşturduğu bir kere Aslında, reaksiyon bozulması ve yan ürünlerin oluşumunu önlemek için soğutulması gerekir. TLC metil esterlerin kantitatif oluşum göstermiştir. 1 ml tuzlu su ilave edilerek reaksiyon karışımı gidermek ve n-heksan (3 x 2 mL) ile özü metil ester. Bir şişeye organik tabakalar toplayın ve daha sonra daha fazla saflaştırılmadan GC analizi için kullanılmıştır metil ester fraksiyonu vermek üzere döner buharlaştırma ile çözgen çıkarın. N-hekzan minimum miktarı (genellikle 5 içinde 1 mg içinde çözülür metil ester0 ul) ve 60 m × 0.25 mm × 0.25 mikron (% 50-cyanopropyl)-methylpolysiloxane sütunu ile donatılmış GC enjekte. Aşağıdaki fırın programı ile alev iyonizasyon dedektörü (FID) kullanın: 165 sıcaklık başlangıç ​​° C, 1 artış izledi 3 dk süreyle basılı tutun ° C / 195 dak ° C kadar, ikinci bir takip 40 dakika için basılı tutun 10 artış ° C / 240 dakikaya kadar ° C, ve 10 dakika için de geçerlidir. Bir sabit basınç modu (29 psi) seçilir. Helyum hidrojen ya da taşıyıcı gaz olarak da kullanılabilir. Metil esterlerin özgün örnekleri arasında tutma süreleri ile karşılaştırılması ile belirlenmiştir. Şekil 10, plazma kolesterol esterleri elde ün bir temsili GC analizi gösterilmektedir. 5. Sentezi (5'R) – ve (5'S) -5 ',8-siklo-2'-deoksiadenosin 1 mM konsantrasyonuna ulaşmak için asetonitril içindeki bir 8-bromo-2'-deoksiadenosin 33 mg (8-Br-taban taşı) (100 mi) eritilir. Fotoreaktör gaz akışı (Ar veya N2) düzenler ve Appa doldurun8-Br-taban taşı çözeltisi ile Ratus. Fotoreaktör girişi için uygun boyutta bir septum hazırlayın ve bunun merkezi aracılığıyla inert gaz hattına bağlı bir iğne geçirin. Septum sistemini kapatın. 30 dakika için inert gaz yıkayın. 22, bir 125 W orta basınçlı cıva buharlı lamba kullanarak, UV ışığı ile irradyasyona uğratırlar ± 2 ° C'de 15 dakika boyunca, bir 250 ml yuvarlak dipli bir şişeye çözelti toplamak. 10 ml asetonitril ile yıkanır ve fotoreaktör aynı şişe içinde yıkama suyu toplamak. 1 M NH4 OH çözelti ile ham tepkime karışımının gidermek ve döner buharlaştırıcıda çözücü buharlaşır. Bilinen şartlar altında analitik sütun ile yüksek performans sıvı kromatografisi analizi (HPLC-UV) (enstrümantasyon bölümüne bakınız) çalıştırmak ve referans bileşikleri ile profil karşılaştırmak. Aşağıdaki sol kullanılarak bir analitik sütun (enstrümentasyon bölümüne bakınız) ile, yüksek performanslı sıvı kromatografisi analizi (HPLC-UV) çalıştırmadelikleri ve gradyanlar: 2 mM amonyum format gibi bir çözücü ve asetonitril çözücü B: 1 ml / dak ve 2.2 dk ulaşılır% 0 çözücü B'den% 0.3 çözücü B için degrade akış hızını ayarlamak için kullanılır. 4.8 dakika içinde 4.0 dak, daha sonra% 1 çözücü B, sonra% 0.8 çözücü B. 6 dakika içinde% 8 çözücü B gidin 9 dakika 1% çözücü B kalın ve. 4 dak% 10 çözücü B'ye gidin ve% 30 çözücü B'ye 5 dakika içinde ve diğer 5 dakika süreyle% 30 solvent B kalır sonra. İki farklı şişeler içinde iki diastereomerik ürün karşılık gelen pik kromatografik toplayın. UV spektrofotometrede iki toplanan fraksiyonların absorbansı ölçülür ve Lambert-Beer yasası (A absorbans A = εlC, ε sönüm katsayısı ve l hücrenin uzunluğu) dayalı kesin miktarını hesaplamak. (260 nm'de 15.400 M -1 cm -1) (Dado) 2'-deoksiadenozin ve sönüm katsayısı ε kullanın. 6. Sentezi (5'R) -, bird (5'S) -5 ',8-siklo-2'-deoksiguanozin Sırasıyla, 1 mM ve 2mM konsantrasyonuna ulaşmak için damıtılmış su (100 mi) içinde 8-bromo-2'-deoksiguanosin 35 mg (8-Br-dGuo) ve sodyum iyodür (NaI) 30 mg eritilir. Fotoreaktör bağlı atıl gaz (Ar ya da N 2) akışını düzenleyen ve reaksiyon çözeltisi ile fotoreaktör doldurun. (B adımına) işlem 5'te tarif edilen reaksiyon karışımı Degass. 22, bir 125 W orta basınçlı cıva buharlı lamba kullanarak, UV ışığı ile irradyasyona uğratırlar ± 2 ° C'de 30 dakika süre ile, 250 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye çözelti toplamak. 10 ml su ile yıkanır ve fotoreaktör aynı şişe içinde yıkama suyu toplamak. 1 M NH4 OH çözelti ile ham tepkime karışımının gidermek ve vakum altında çözücü buharlaşır. (G adım e) Prosedür 5 açıklandığı gibi analiz gerçekleştirin. (260 nm'de 11.700 M -1 cm -1) (dGuo) 2'-deoksiguanozin ve sönüm katsayısı ε kullanın. 7. İzotop Etiketli Pürin (5'R) Sentezi – ve (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides 15 N izotopik olarak etiketlenmiş pürin nükleosit 1mM sulu çözelti (damıtılmış su), 2 ml hazırlayın ([15N 5] taban taşı veya [15N 5] dGuo) bir septum kapaklı bir cam şişeye (4 ml) içinde. Septum kapaklı flakon bağlayın ve flakon alt ulaşır septumda bir iğne aracılığıyla gaz hattı (çözüm doygunluğu için N 2 O) bağlayın. Septum kap içinde bir başka kısa iğne gaz çıkışı olarak çalışır. 30 dk N 2 O ile çözümü yıkayın. Gaz akışı çok düşük olduğu için düzenlenir. Çıkış iğne birinci dışarı alınır ve 1 'den sonra ve uzun bir şişe içinde küçük bir basınç elde etmek için, aşağıdaki edilir. 8 saat (bir doz oranı ca. 4,5 Gy / dak 'lık temelinde hesaplanmıştır) için gama radyoliz aygıtı içinde çözelti koyun. Reaksiyon 1 M NH4 ile söndürmeden sonra ham </sub> çözüm OH. Bilinen şartlar altında 6 yüksek performanslı sıvı kromatografik analizi (HPLC-UV) çalıştırın ve standart referanslar kromatogram karşılaştırın. 8. DNA Sulu çözeltilerin Gama Radyoliz 0.5 mg / dana timus DNA, bir ml solüsyon (damıtılmış su) 1 ml hazırlayın ve kap bir septum ile bir cam şişeye (2 ml) içinde koydu. (Adım bd) prosedür 7'de tarif edildiği gibi reaksiyona Degass. 30 dk (doz / kuru ca. 4,5 Gy / dak 'lık temelinde hesaplanmıştır) için gama radyoliz aygıtı içinde çözelti koyun. 9. DNA'nın enzimatik sindiriminden DNA 80 ug ihtiva eden bir Eppendorf tüpü için, nükleaz P1, fosfodiesteraz II, 300 mM sodyum asetat (pH 5.6) ve 10 mM çinko klorür, 20 ul içinde 20 nmol EHNA, 0.01 U-8 U ekleyin. 48 saat süreyle 37 ° C'de inkübe karışım. Sonraki alkalin fosfataz 8 U oluşan bir karışım, phosphodiesteras 0.02 U eklemeke I, karışım sindirim ile 0.5 M Tris-HCl tampon (pH 8.9), 40 ul. Örnek 2 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edilir. Karışım,% 10 formik asit ilave edilerek nötralize edilir. Bir Amicon Ultra-0.5 santrifüj filtre cihazı (kesim noktası 3 kDa) için örnek aktarın, tridistilled H 2 O 200 ul ekleyin 15 dakika boyunca 14.000 xg'de santrifüj rotor içine Ultra filtre yerleştirin. Sonra mikrosantrifüj tüp Ultra filtre cihazı ayırın. Mikrosantrifüj tüp enzim ücretsiz bir çözüm Lyophilize. 10. Analiz öncesinde DNA Sample Tuz Giderme Analitik kolon ile yüksek performanslı sıvı kromatografik analizi (HPLC-UV) (enstrümentasyon bölümüne bakınız) bilinen aşağıdaki şartlar. 6 çalıştırın H2O 20 ul içinde liyofilize sindirilmiş DNA çözülür ve HPLC-UV olarak enjekte edilir. Tuz elüsyon (ilk dakika) sonra sağ ve elüsyon tim önce bir flakon örnek toplayınkromatografik programın sonuna kadar ilk nükleozid (5'R-cdGuo), e. Örnek liyofilize edildi ve 20 ul su içinde resolubilized edilir. 11. LC-MS/MS Kantitatif Analiz Analitik yöntem ve detektör MS (ESI) için yükleme yöntemi ile analiz başlamadan önce HPLC-MS/MS (üçlü dört kutuplu) hazırlayın. 6 Prosedür 7 de hazırlanan numune içinde izotopik olarak etiketlenmiş bileşikleri karışımı 1 ul ekle. Distile su içinde çivili sindirilmiş DNA çözeltisi 20 ul enjekte edilir. Elde edilen kromatografik veri referans bileşikleri ile önceki ayarlama bazında ele alınmaktadır. Bir temsilci HPLC adenozin ve 2'-deoksiribonükleosidler ve oksidatif ve siklo türevleri guanozin Şekil 11'de gösterilmiştir içeren çalıştırın.