Radicales Libres en Biología Química: del comportamiento químico al desarrollo de biomarcadores

1. Síntesis de Mono-isómeros trans de ésteres de colesterol Disolver los ésteres de colesterol (linoleato o araquidonato de éster de colesterilo) en 2-propanol (15 mM). Para una mejor solubilización, las muestras se sonicaron durante 15 min en atmósfera de argón. Transferir la solución a un reactor fotoquímico de cuarzo, añadir 2-mercaptoetanol en 2-propanol (para llegar a 7 mM de concentración, a partir de una solución madre 2 M del tiol). Lavar la mezcla de reacción con argón durante 20 min con el fin de eliminar la presencia de oxígeno en la solución. Irradiar la mezcla de reacción por la luz UV usando un 5.5W baja presión lámpara de mercurio a 22 ± 2 ° C durante 4 min. Monitor de Ag-analítico por TLC (plata-cromatografía de capa fina) a la evidencia de la formación de los ésteres de mono-trans colesterilo (véase la Figura 1 para las fórmulas químicas). La tinción de TLC se lleva a cabo mediante el vertido de la placa en el molibdato de amonio cerio (CAM) solución, y los puntos aparecen en calefacciónla placa. Se detiene la reacción en una etapa temprana, a fin de recuperar el material de partida, que puede ser reutilizado para realizar otras rondas de isomerización, la obtención de un aumento de la producción total. Recoger la mezcla de reacción en un matraz de fondo redondo, de lavar el aparato con unos pocos ml de 2-propanol. Eliminar el disolvente y purificar los isómeros trans de los mono-ésteres de colesterol por Ag-TLC como se describe en la literatura. 5 Uso hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluyente para mono-trans isómeros linoleato de colesterilo, mientras hexano uso -dietil éter-ácido acético (9:1:0,1 v / v) para mono-trans isómeros de colesterilo araquidonato. 2. Aislamiento de la fracción de ésteres de colesterol del suero humano Diluir 1 ml de suero humano (obtenido por centrifugación de sangre) con 1 ml de salmuera y se vierte la disolución en un embudo de separación en una corriente de argón a fin de evitar los artefactos (por ejemplo, aductos de oxidación). Añadir 10 ml de cloroformo-metanol (2: 1 v / v) tres veces. Agitar el embudo de separación muy lentamente a fin de limitar la formación de la emulsión debido a la presencia de albúmina. Se lavan las capas orgánicas una vez con salmuera (10 ml), se recolecta en un matraz Erlenmeyer bajo un flujo de argón, se seca sobre sulfato de sodio anhidro. Eliminar los volátiles mediante evaporador rotatorio para dar un aceite amarillo (fracción total de lípidos en plasma). Se recoge el crudo con 1 ml de cloroformo-metanol (2:1 v / v), carga sobre una TLC preparativa en una corriente de argón y el uso de una mezcla de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluyente . Raspar la porción de sílice que contiene la fracción de éster de colesterol y se vierte en un vial. A continuación, extraer sílice (3 x 5 ml) con cloroformo-metanol (2:1 v / v), recoger las capas orgánica y eliminar el disolvente después de la evaporación para dar la fracción pura de ésteres de colesterol (normalmente ~ 1,5 mg). Mantener los ésteres de colesterol en un frasco de vidrio oscuro cubierto por una lámina de aluminio en atmósfera de argón y se almacena a -20 ° C. Colesteril esters son sensibles a la luz y el oxígeno. 3. Caracterización de Mono-trans ésteres de colesterol por espectroscopia Raman Extracto de ésteres de colesterol de suero humano (≥ 0,7 mg) como se describe en la sección 2, se disuelven en una pequeña cantidad de tetracloruro de carbono (≤ 10 l), y meterlo en un frasco. CCl 4 se selecciona como disolvente, ya que su señal Raman no se solapa con la región de interés del análisis de éster de colesterilo. Transferir la solución a la titular de la muestra a través de una pipeta de vidrio desechable, a continuación, retirar cuidadosamente el disolvente mediante una lenta corriente de argón. Una vez que una película oleosa uniforme se forma en la pared interna del soporte de muestras, colocar este último en el instrumento de medición. Transformada de Fourier del espectro Raman de los ésteres de colesterol se obtiene directamente en los extractos de lípidos sin ninguna reacción de derivatización. La potencia del láser en la muestra es <100 mW para evitar el daño de la muestra. El número total de exploracionespara cada espectro es ≥ 800 para reducir al mínimo el ruido de fondo. El rango de 1,700-1,630 cm -1 del espectro Raman se analiza ya que refleja la contribución de los enlaces C = C dobles presentes en la molécula (C = C modo de estiramiento). Un análisis de ajuste de curva se lleva a cabo en esta región, lo que permite la distinción de las contribuciones superpuestas de cis y trans dobles enlaces en la cadena de alquilo graso y doble enlace en el anillo B de colesterol (véase la Figura 2). Para colocar correctamente las bandas vibracionales, algunos parámetros deben ser fijos o limitados dentro de unos límites razonables. Los perfiles de pico del componente se describe como una combinación lineal de Lorentzian y funciones gaussianas, mientras que los anchos de banda de altura media se determina mejor mediante la rutina de optimización del equipo. El número y la posición de los picos de los componentes se obtienen mediante el uso de los espectros cuarto derivado, que permiten detectar también algunas bandas débiles de componentes. Puesto que la señala ruido que se deteriora la diferenciación de la señal puede impedir el uso de la cuarta derivada, se alisó con una cuarta derivados de trece puntos Savitsky-Golay función, son de ventaja, por lo tanto, un buen compromiso entre la resolución y la relación de señal a ruido se obtiene . Lo mejor ajuste de la curva se obtienen en los más bajos posibles c 2 valores. La presencia de isómeros trans es revelada por el componente a 1671 ± 1 cm -1, además de, al menos, los dos componentes, ligeramente desplazado hacia frecuencias más bajas, debido a la cadena de ácido graso y de colesterol C = C enlaces dobles. Espectro Raman representante de plasma de éster de colesterilo se muestra en la Figura 9. En el recuadro de la comparación de una región específica con colesteril linoleato y mono-trans colesterilo isómeros de ácido linoleico se muestra. 4. La derivatización de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y análisis por cromatografía de gases Disolverésteres de colesterol (~ 1,5 mg) con 0,5 ml de una solución 1 M de hidróxido de sodio en benceno-metanol (2:3 v / v) y colocar en un frasco de vidrio oscuro cubierto por una lámina de aluminio en atmósfera de argón. Dejar la mezcla en agitación a temperatura ambiente y el monitor por TLC usando una mezcla de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluyente. El tiempo de reacción es normalmente 30 minutos, pero una cuidadosa monitorización de la reacción se requiere. De hecho, una vez que los correspondientes ésteres metílicos se forman, la reacción debe ser apagado para evitar la formación de productos de degradación y de lado. TLC mostró la formación cuantitativa de los ésteres metílicos. Interrumpir la mezcla de reacción mediante la adición de 1 ml de salmuera y extraer los ésteres metílicos con n-hexano (3 x 2 ml). Recoger las capas orgánicas en un vial y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria para dar la fracción de éster de metilo, que luego se utiliza para el análisis de GC sin purificación adicional. Disolver los ésteres de metilo en la mínima cantidad de n-hexano (generalmente 1 mg en 50 l) y se inyecta en el GC equipado con un m 60 x 0,25 mm x 0,25 m (50%-cianopropil)-metilpolisiloxano columna. Utilice un detector de ionización de llama (FID) con el programa del horno siguientes: temperatura de comienzo a 165 ° C, mantenida durante 3 min, seguido por aumento de 1 ° C / min hasta 195 ° C, mantenida durante 40 min, seguido de un segundo aumentar de 10 ° C / min hasta 240 ° C, y mantener durante 10 min. A modo de presión constante (29 psi) se elige. Helio o hidrógeno puede ser utilizado como el gas portador. Los ésteres metílicos se identifican por comparación con los tiempos de retención de muestras auténticas. Figura 10 muestra un análisis representativo de FAME GC obtenido a partir de ésteres de colesterol en plasma. 5. Síntesis de (5'R) – y (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-desoxiadenosina Disolver 33 mg de 8-bromo-2'-desoxiadenosina (8-Br-DADO) en acetonitrilo (100 ml) para llegar a la concentración de 1 mM. Regular el flujo de gas (Ar o N2) en la fotorreactor y llenar el apparatus con la solución de 8-Br-ranurar. Preparar un tabique con el tamaño adecuado para la entrada del fotorreactor y pasar una aguja conectada a la línea de gas inerte a través del centro de la misma. Cierre el sistema con el tabique. Enjuague el gas inerte durante 30 min. Irradiar por la luz UV usando un 125W de media presión lámpara de mercurio a 22 ± 2 ° C durante 15 min, recoger la solución de 250 ml en un matraz de fondo redondo. Lavar el fotorreactor con 10 ml de acetonitrilo y recoger de lavado en el mismo matraz. Interrumpir la mezcla de reacción en bruto con 1 M NH 4 OH solución y se evapora el disolvente en el evaporador rotativo. Ejecutar análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC-UV) con columna de análisis (ver sección instrumentación) en condiciones conocidas, y comparar el perfil con compuestos de referencia. Ejecutar líquida de alto rendimiento análisis cromatográfico (HPLC-UV) con una columna analítica (véase la sección de instrumentación) mediante la siguiente solrespiraderos y degradados: 2 mM de formiato de amonio como disolvente A y acetonitrilo como disolvente B. Configuración de la tasa de flujo de 1 ml / min y el gradiente de 0% de disolvente B a 0,3% de disolvente B a ser alcanzado en 2,2 min. Entonces B 0,8% en disolvente en 4,0 min, entonces B 1% de disolvente en 4,8 min. Permanecer en 1% de disolvente B durante 9 minutos y luego ir a 8% de disolvente B en 6 min. Después de ir a 10% de disolvente B en 4 min y al 30% de disolvente B en 5 min y se mantienen a 30% de disolvente B durante otros 5 min. Recoger los picos cromatográficos correspondientes a los dos productos diastereoméricos en dos viales diferentes. Medir la absorbancia de las dos fracciones recogidas en el espectrofotómetro de UV y calcular la concentración exacta basada en la ley de Beer-Lamber (A εlC =, donde A es la absorbancia, ε el coeficiente de extinción y l la longitud de la célula). Utilice el coeficiente de extinción ε de 2'-desoxiadenosina (DADO) (15.400 M -1 cm -1 a 260 nm). 6. Síntesis de (5'R) – unad (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-desoxiguanosina Disolver 35 mg de 8-bromo-2'-desoxiguanosina (8-Br-dGuo) y 30 mg de yoduro de sodio (NaI) en agua destilada (100 ml) para llegar a la concentración de 1 mM y 2 mM, respectivamente. Regular gas inerte (Ar o N 2) de flujo conectado a la fotorreactor y llenar el fotorreactor con la solución de reacción. Desgasifique la mezcla de reacción como se describe en el procedimiento 5 (paso b). Irradiar por la luz UV usando un 125W de media presión lámpara de mercurio a 22 ± 2 ° C durante 30 min, recoger la solución de 250 ml en un matraz de fondo redondo. Lavar el fotorreactor con 10 ml de agua y recoger de lavado en el mismo matraz. Interrumpir la mezcla de reacción en bruto con 1 M NH 4 OH solución y se evapora el disolvente bajo vacío. Realizar el análisis como se describe en el Procedimiento 5 (pasos E a G). Utilice el coeficiente de extinción ε de 2'-desoxiguanosina (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 a 260 nm). 7. Síntesis de purina isotópico Labeled (5'R) – y (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides Preparar 2 ml de solución acuosa 1 mM (agua destilada) de los 15 N isotópica nucleósidos de purina etiquetados ([15N 5] Dado o [15N 5] dGuo) en un vial de vidrio (4 ml) con un tapón de séptum. Conectar el vial con el tapón de septo y conectarse a la línea de gas (N 2 O para la saturación de la solución) a través de una aguja en el tabique que llega al fondo del vial. Otra aguja corta en el tapón septum funciona como la salida de gas. Lavar la solución con N 2 O durante 30 min. El flujo de gas se regula para que sea muy baja. La aguja de salida es primero retirado y después de 1 'el tiempo siguiente, con el fin de tener una pequeña presión en el interior del vial. Dejar la solución en un aparato de radiólisis gamma durante 8 horas (cálculo sobre la base de una tasa de dosis ca. 4,5 Gy / min). Después de apagar la reacción en bruto con 1 M NH 4 </sub> OH solución. Ejecutar análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC-UV) bajo condiciones conocidas, 6 y comparar el cromatograma con las referencias estándar. 8. Gamma radiólisis de soluciones de ADN acuosas Preparar 1 ml de 0,5 mg / ml de solución (agua destilada) de ADN de timo de ternera y poner en un vial de vidrio (2 ml) con un tapón de séptum. Desgasifique la reacción como se describe en el Procedimiento 7 (pasos bd). Dejar la solución en un aparato de radiólisis gamma durante 30 min (cálculo sobre la base de ca dosis / velocidad. 4,5 Gy / min). 9. La digestión enzimática de ADN A un tubo Eppendorf que contenía 80 g de ADN, añadir 8 U de nucleasa P1, 0,01 U de la fosfodiesterasa II, 20 nmol de EHNA en 20 l de acetato de sodio 300 mM (pH 5,6) y 10 mM de cloruro de zinc. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 48 hr. A continuación añadir una mezcla de 8 U de fosfatasa alcalina, 0,02 U de phosphodiesterase I, en 40 l de 0,5 M Tris-HCl (pH 8,9) a la digestión mezcla. La muestra se incuba a 37 ° C durante 2 horas. La mezcla se neutralizó mediante la adición de 10% de ácido fórmico. Transferir la muestra a un Amicon Ultra-0.5 dispositivo de filtro centrífugo (punto de corte de 3 kDa), añadir 200 l de tridestilada H 2 O. Coloque el Ultra-filtro en el rotor de la centrífuga a 14.000 xg durante 15 min. A continuación, separar el dispositivo de filtro Ultra desde el tubo de microcentrífuga. Liofilizar la solución libre de enzimas en el tubo de microcentrífuga. 10. Desalinización del ADN de muestra antes del análisis Ejecutar líquida de alto rendimiento análisis cromatográfico (HPLC-UV) con columna de análisis (ver sección instrumentación) siguiendo las condiciones conocidas. 6 Disolver el liofilizado ADN digerido en 20 l de H 2 O y se inyecta en el HPLC-UV. Recoger la muestra en un vial después de la elución de sal (primeros minutos) y justo antes de la elución time del primer nucleósido (5'R-cdGuo), hasta el final del programa cromatográfico. La muestra se liofilizó y se redisuelve en 20 l de agua. 11. LC-MS/MS Análisis Cuantitativo Preparar los HPLC-MS/MS (triple cuadrupolo) antes de iniciar el análisis mediante la carga del método de análisis y el método para el detector de MS (ESI). 6 Añadir 1 l de la mezcla de compuestos marcados con isótopos en la muestra preparada en el Procedimiento 7. Inyectar 20 l de la solución de ADN digerido con púas en agua destilada. Los datos cromatográficos obtenidos se elaboran sobre la base de la calibración previa con compuestos de referencia. Un representante ejecutar HPLC que contiene adenosina y guanosina 2'-desoxirribonucleósidos y su oxidativos y derivados cíclicos se muestra en la Figura 11.