Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

Ein. Synthese von Mono-trans-Isomere von Cholesterylestern Aufzulösen Cholesterylestern (Linoleat oder Arachidonat Cholesterylester) in 2-Propanol (15 mM). Zum besseren Solubilisierung wurden die Proben für 15 Minuten unter Argon mit Ultraschall behandelt. Die Lösung wird in einem Quarz-photochemischen Reaktor, add 2-Mercaptoethanol in 2-Propanol (bis 7 mM Konzentration zu erreichen, von einer 2 M Stammlösung des Thiol). Spülen der Reaktionsmischung mit Argon für 20 min, um die Anwesenheit von Sauerstoff in der Lösung zu beseitigen. Bestrahlen der Reaktionsmischung mit UV-Licht unter Verwendung einer niedrigen 5.5W Quecksilberhochdrucklampe bei 22 ± 2 ° C für 4 min. Monitor durch analytische Ag-TLC (Silber-Dünnschichtchromatographie) zum Nachweis der Bildung der mono-trans Cholesterylestern (siehe Abbildung 1 für die chemische Formeln). Die TLC-Färbung erfolgt durch Gießen der Platte in der Cer-Ammonium molibdate (CAM)-Lösung durchgeführt, und die Flecken beim Erhitzendie Platte. Die Reaktion wird in einem frühen Stadium, um das Ausgangsmaterial, das wiederverwendet zu anderen Runden der Isomerisierung, Erhalten einer Erhöhung der Gesamtausbeute durchführen kann erholen. Sammeln das Reaktionsgemisch in einem Rundkolben, Waschen der Apparatur mit einigen ml 2-Propanol. Entfernen des Lösungsmittels und Reinigung der Mono-trans Isomeren von Cholesterylestern durch Ag-TLC wie in der Literatur beschrieben. 5 Verwendung Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens für Mono-trans Isomeren Cholesteryl-Linoleat, wohingegen die Verwendung Hexan -Diethylether-essigsäure (9:1:0,1 v / v) für Mono-trans Cholesteryl Arachidonat Isomere. 2. Isolation von Cholesterylestern Fraktion aus menschlichem Serum Verdünnte 1 ml Humanserum (erhalten durch Zentrifugation des Blutes) mit 1 ml Kochsalzlösung und die Lösung in einem Scheidetrichter unter einem Argonstrom um Artefakte (zB Oxidation Addukte) zu vermeiden. 10 ml Chloroform-Methanol (2: 1 v / v) dreimal. Schütteln den Scheidetrichter nur langsam um die Bildung der Emulsion durch die Gegenwart von Albumin zu begrenzen. Wäscht die organischen Schichten einmal mit Kochsalzlösung (10 ml), dann in einem Erlenmeyerkolben sammeln unter einem Argonstrom, über wasserfreiem Natriumsulfat. Entfernen von flüchtigen Rotationsverdampfer zu einem gelben Öl (gesamten Plasma Lipidfraktion) zu ergeben. Aufnahme der rohen mit 1 ml Chloroform-Methanol (2:1 v / v), Last auf eine präparative TLC unter einem Strom von Argon und eine Mischung aus Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens . Abkratzen Kieselsäure enthaltenden Abschnitt der Cholesterylester Fraktion und gießen Sie in einem Fläschchen. Dann extrahiert Siliciumdioxid (3 × 5 ml) mit Chloroform-Methanol (2:1 v / v), sammeln die organischen Schichten und Entfernen des Lösungsmittels nach dem Eindampfen das reine Fraktion von Cholesterylestern (normalerweise ~ 1,5 mg) zu ergeben. Halten Cholesterylestern in einer dunklen Glasflasche mit Aluminiumfolie unter Argon und speichern abgedeckt bei -20 ° C. Cholesteryl esters sind empfindlich gegenüber Licht und Sauerstoff. 3. Charakterisierung von Mono-trans Cholesterylestern durch Raman-Spektroskopie Auszug Cholesterylestern aus menschlichem Serum (≥ 0,7 mg), wie in Abschnitt 2 beschrieben, in einer kleinen Menge von Tetrachlorkohlenstoff (≤ 10 ul) und in einem Fläschchen aufzulösen. CCl 4 als Lösungsmittel gewählt, weil seine Raman-Signal nicht mit dem Bereich von Interesse von Cholesterylester Analyse überlappen. Die Lösung wird in den Probenhalter durch einen Einweg Glaspipette, dann vorsichtig das Lösemittel durch einen langsamen Strom von Argon. Sobald eine gleichmäßige öligen Film auf der Innenwand des Probenhalters ausgebildet ist, versetzen die letztere in das Instrument für die Messung. Fouriertransformiert Ramanspektrum von Cholesterylestern direkt auf der Lipidextrakte ohne Derivatisierungsreaktion erzielt. Die Laserleistung auf der Probe <100 mW zu Probe zu vermeiden. Die Gesamtzahl von Abtastungenfür jedes Spektrum ist ≥ 800 um das Hintergrundrauschen zu minimieren. Die 1,700-1,630 cm -1 des Raman-Spektrums analysiert wird, da sie die Abgabe auf die C = C-Doppelbindungen im Molekül (C = C-Streckschwingung) spiegelt. Eine Kurvenanpassung Analyse basiert auf diesem Gebiet durchgeführt, wodurch die Unterscheidung der überlagerten Beiträge von cis-und trans-Doppelbindungen in der Fettalkylkette und Doppelbindung im Ring B von Cholesterin (siehe Abbildung 2). Um richtig die Banden passen, sollten einige Parameter fest oder eingeschränkt in vernünftigen Grenzen. Die Komponente Peakprofile werden als eine lineare Kombination von Lorentz-und Gauß-Funktionen beschrieben, während die halbe Höhe Bandbreiten besten durch den Computer Optimierungsroutine ermittelt werden. Die Anzahl und die Position der Komponente Peaks werden durch Verwendung des vierten Ableitungsspektren, die auch erkennen einige schwache Komponente Bands erlauben erhalten. Da das SignalRausch-Verhältnis das auf Differenzierung des Signals verschlechtert können die Verwendung des vierten Derivat auszuschließen, geglättet vierte Derivate mit einer Dreizehn-Punkt Savitsky-Golay-Funktion, von Vorteil; somit ein Kompromiss zwischen der rechten Auflösung und des Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird . Beste Kurvenanpassung auf der niedrigsten möglichen c 2 erhaltenen Werte. Die Anwesenheit von trans-Isomere wird durch die Komponente bei 1671 ± 1 cm -1 zusätzlich zu zumindest die beiden Komponenten, leicht zu niedrigeren Frequenzen hin verschoben wird, aufgrund der Fettsäurekette und Cholesterin C = C-Doppelbindungen offenbart. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester ist in 9 gezeigt. Im Einschub der Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Mono-trans Cholesteryl Linolsäureisomeren gezeigt. 4. Derivatisierung zu Fatty Acid Methylester (FAME) und Analyse mittels Gaschromatographie AuflösenCholesterylestern (~ 1,5 mg) mit 0,5 ml einer 1 M Lösung von Natriumhydroxid in Methanol-Benzol (2:3 v / v) und in einen dunklen Fläschchen durch Aluminiumfolie unter Argon abgedeckt. Lassen Sie die Mischung unter Rühren bei Raumtemperatur und Monitor durch DC unter Verwendung einer Mischung von Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens. Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 30 Minuten Reaktion aber eine sorgfältige Überwachung erforderlich. In der Tat, wenn die entsprechenden Methylester gebildet werden, muß die Reaktion abgeschreckt, um die Bildung von Abbau-und Nebenprodukten zu vermeiden. TLC zeigten die quantitative Bildung von Methylestern. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml Kochsalzlösung und extrahiert Methylester mit n-Hexan (3 × 2 ml). Sammeln der organischen Schichten in eine Phiole und Entfernen des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um den Methylester Fraktion, die dann für die GC-Analyse wird ohne weitere Reinigung verwendet leisten. Man löst die Methylester in der Mindestmenge n-Hexan (üblicherweise 1 mg in 50 ul) und injizieren im GC mit einer 60 m × 0,25 mm × 0,25 um (50%-Cyanopropyl)-Methylpolysiloxan Kolonnenkopf ausgestattet. Verwenden einen Flammenionisationsdetektor (FID) mit folgendem Programm Ofen: Temperatur Beginn bei 165 ° C für 3 min, durch Erhöhung von 1 gefolgt halten ° C / min bis zu 195 ° C, für 40 min, gefolgt von einer zweiten halten Erhöhung von 10 ° C / min bis zu 240 ° C und für 10 min halten. Ein konstanter Druck-Modus (29 psi) ausgewählt wird. Helium oder Wasserstoff als Trägergas verwendet werden. Methylester werden durch Vergleich mit den Retentionszeiten von authentischen Proben identifiziert. Abbildung 10 zeigt eine repräsentative GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten. 5. Synthese von (5'R) – und (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-desoxyadenosin Man löst 33 mg 8-Brom-2'-desoxyadenosin (8-Br-DADO) in Acetonitril (100 ml), um 1 mM Konzentration erreichen. Regeln Gasstrom (Ar oder N2) im Photoreaktor und füllen den apparatus mit der Lösung von 8-Br-DADO. Vorbereiten eines Septums mit der entsprechenden Größe für die Eingangs-und Photoreaktor passieren eine Nadel, die mit dem Inertgas Linie durch die Mitte davon. Schließen Sie das System mit dem Septum. Spülen des Inertgases für 30 min. Strahlen durch UV-Licht mit einer 125W Quecksilber-Mitteldruck-Lampen bei 22 ± 2 ° C für 15 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml-Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Acetonitril und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche. Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH 4 OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) unter bekannten Bedingungen und vergleichen das Profil mit Referenz-Verbindungen. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit einer analytischen Säule (siehe Instrumentierung Abschnitt) mithilfe der folgenden solLüftungsschlitze und Steigungen: 2 mM Ammoniumformiat als Lösungsmittel A und Acetonitril als Lösungsmittel B. Setzen Sie die Flussrate auf 1 ml / min und der Gradient von 0% Lösungsmittel B bis 0,3% Lösungsmittel B in 2,2 min erreicht werden. Dann wurden 0,8% Lösungsmittel B in in 4,0 min, dann 1% Lösungsmittel B in 4,8 min. Unverändert auf 1% Lösungsmittel B für 9 min und dann bis 8% Lösungsmittel B in 6 min. Nach gehe zu 10% Lösungsmittel B in 4 min und 30% Lösungsmittel B in 5 min und bleiben bei 30% Lösungsmittel b für andere 5 min. Sammeln der chromatographischen Peaks, die den beiden diastereomeren Produkte in zwei verschiedene Ampullen. Die Extinktion der beiden gesammelten Fraktionen im UV-Spektrophotometer und berechnen die exakte Konzentration auf der Lamber-Beer-Gesetz (A = εlC, wobei A die Extinktion der Extinktionskoeffizient ε und l die Länge der Zelle) basiert. Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2'-Desoxyadenosin (Dado) (15.400 M -1 cm -1 bei 260 nm). 6. Synthese von (5'R) – eind (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-Desoxyguanosin Man löst 35 mg 8-Brom-2'-desoxyguanosin (8-Br-dGuo) und 30 mg Natriumiodid (NaI) in destilliertem Wasser (100 ml) um 1mm und 2mm Konzentration zu erreichen sind. Regulate Inertgas (Ar oder N 2) fließen mit dem Photoreaktor und füllen Sie den Photoreaktor mit der Reaktionslösung. Entgasen das Reaktionsgemisch wie in Verfahren 5 beschrieben (Schritt b). Durch UV-Licht bestrahlt Verwendung einer 125W-Mitteldruck-Quecksilberlampe bei 22 ± 2 ° C für 30 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Wasser und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche. Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH 4 OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Vakuum. Führen Analyse wie in Prozedur 5 beschrieben (Schritte e bis g). Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 bei 260 nm). 7. Synthese von Isotopen markiertes Purine (5'R) – und (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides Planen 2 ml 1 mM wässrige Lösung (destilliertes Wasser) von den 15 N Isotopen markierten Purinnukleoside ([15N 5] DADO oder [15N 5] dGuo) in einem Glasfläschchen (4 ml) mit einem Septumverschluss. Schließen Sie das Fläschchen mit dem Septum und an der Gasleitung (N 2 O für die Sättigung der Lösung) durch eine Nadel in der Scheidewand, die den Boden des Fläschchens erreicht. Eine weitere kurze Nadel im Septum arbeitet als Gasaustritt. Spülen Sie die Lösung mit N 2 O für 30 min. Der Gasstrom wird so reguliert, sehr gering sein. Die Ausfahrt Nadel ersten herausgenommen und nach 1 'der Lange folgt, um einen kleinen Druck im Inneren des Fläschchens haben. Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse für 8 h (Berechnung auf der Grundlage einer Dosisrate ca. 4,5 Gy / min). Nach der Reaktion zu stillen das Rohprodukt mit 1 M NH 4 </sub> OH Lösung. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) unter bekannten Bedingungen, 6 und vergleichen Sie das Chromatogramm mit den Standard-Referenzen. 8. Gamma Radiolyse von DNA wässrigen Lösungen Bereiten Sie 1 ml von 0,5 mg / ml Lösung (destilliertes Wasser) von Kalbsthymus-DNA und in einem Glasfläschchen (2 ml) mit einem Septum. Entgasen die Reaktion nach Verfahren 7 beschrieben (Schritte bd). Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse und 30 min (Berechnung auf der Basis der Dosis / Rate ca.. 4,5 Gy / min). 9. Enzymatische Verdauung von DNA In ein Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 80 ug DNA, fügen 8 U von Nuklease P1, 0,01 U von Phosphodiesterase II, 20 nmol EHNA in 20 ul 300 mM Natriumacetat (pH 5,6) und 10 mM Zinkchlorid. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 48 Stunden. Als nächstes fügen Sie eine Mischung aus 8 U alkalischer Phosphatase, 0,02 U phosphodiesterasE I, in 40 ul 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,9) zu Mischung Verdauung. Die Probe wird bei 37 ° C für 2 Stunden inkubiert. Das Gemisch wird durch Zugabe von 10% iger Ameisensäure neutralisiert. Übertragung der Probe auf eine Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfilter Vorrichtung (cutoff 3 kDa), 200 ul tridestilliertem H 2 O. Legen Sie die Ultra-Filter in den Zentrifugenrotor bei 14.000 xg für 15 min. Dann trennen Sie die Ultra Filter Gerät aus der Mikrozentrifugenröhrchen. Lyophilisieren das Enzym-freie Lösung im Mikrozentrifugenröhrchen. 10. DNA-Probe Entsalzung vor der Analyse Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) nach bekannten Bedingungen. 6 Lösen des lyophilisierten verdaute DNA in 20 ul H 2 O und injizieren in HPLC-UV. Sammeln der Probe in einem Fläschchen nach dem Salzelution (erste Minuten) und gerade vor der Elution time des ersten Nucleosids (5'R-cdGuo), bis zum Ende des chromatographischen Programm. Die Probe wird lyophilisiert und resolubilisiert in 20 ul Wasser. 11. LC-MS/MS Quantitative Analysis Bereiten Sie die HPLC-MS/MS (Triple-Quadrupol), bevor die Analyse durch das Laden der analytischen Methode und das Verfahren für den MS-Detektor (ESI). 6 Fügen Sie 1 ul der Isotopen-markierten Verbindungen Mischung in der Probe im Verfahren 7 vorbereitet. Inject 20 ul der spiked verdaut DNA-Lösung in destilliertem Wasser. Die erhaltenen chromatographischen Daten werden auf der Grundlage der bisherigen Kalibrierung mit Referenz-Verbindungen erarbeitet. Eine repräsentative HPLC laufen mit Adenosin und Guanosin-2'-Desoxyribonukleoside und ihre oxidative und Cyclo-Derivaten ist in Abbildung 11 dargestellt.